王丽萍1*，李祥1，师春兰1，彭西峰2

 1．陕西科技大学化学与化工学院（西安710021）；2．九江学院(九江332005)

摘要  以氧化淀粉为原料，采用液化工艺，研究a-淀粉酶加量、体系pH、酶解温度、酶解时间等对水解液中葡萄糖醛酸含量的影响，在此基础上采用正交法优化氧化淀粉最佳液化条件，在其它条件不变的情况下，当体系pH为6.5、a-淀粉酶加量为12 m L，酶解温度为85℃，酶解60 min时，水解液中葡萄糖醛酸含量可达到9.89%，该研究为高含量葡萄糖醛酸的制备奠定了基础。

关键词  氧化淀粉；液化；a-淀粉酶；葡萄糖醛酸

  葡萄糖醛酸是葡萄糖的伯醇羟基被氧化成羧基形成的化合物，因分子中同时存在高反应活性的醛基和羧基，可与人体内源性及外源性有毒物质中的羟基、巯基、羧基、氨基等作用，达到排毒养颜的目的，现已被广泛地应用于功能性饮料、食品、减肥药、化妆品等的添加剂中。葡萄糖醛酸又可以内酯化形成呋喃环3，6-内酯，即葡萄糖醛酸内酯，它是人体结缔组织及胶原的主要成分，是治疗慢性肝炎、肝硬化、关节炎及胶原疾病的良药。现阶段对于葡萄糖醛酸制备方法研究最广泛的是芬顿试剂氧化法，即淀粉分子中的6-OH在芬顿试剂的作用下被氧化为羧基，原淀粉被氧化成为氧化淀粉，氧化淀粉在淀粉酶、糖化酶的作用下水解为葡萄糖醛酸。

  试验以氧化淀粉为原料，以葡萄糖醛酸含量为评价指标，重点研究氧化淀粉在a-淀粉酶（液化酶）的作用下葡萄糖醛酸的变化规律，研究发现在最佳液化条件下，水解液中葡萄糖醛酸含量可达9.89%，该研究为绿色环保的葡萄糖醛酸生产工艺奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

 氧化淀粉：实验室自制；氢氧化钠、盐酸、3，5-二硝基水杨酸、丙三醇、葡萄糖、间羟基联苯、葡萄糖醛酸标准品：均为分析纯，购于西安化学试剂公司。

1.1.2设备与仪器

 D60-2F型电动搅拌机：杭州仪表电机厂；HH-2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；PB-10型酸度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；7230 G型可见分光光度计：上海科技仪器有限公司制造；ThermoFisher Scientific Nicolet 6700 FT-IR傅里叶变换红外光谱仪（美国）。

1.2方法

1.2.1葡萄糖醛酸标准曲线的绘制及水解液的测定

 1)称取0.1 g葡萄糖醛酸标准品置于100 m L容量瓶中，加水定容，配得1.00 mg/m L的葡萄糖醛酸标准液。

 2)取上述标准液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 m L分别置于10 m L的具塞试管中，在冰水浴中加入5 m L四硼酸钠／硫酸溶液，摇匀，在沸水浴中加热5min后冷却，将试管置于冰水浴中，用微量移液器精确加入1.5 mg/m L的间羟基联苯100μ L，盖上塞子摇匀，以1 m L蒸馏水做空白，在520 nm处测定吸光度，以标准葡萄糖醛酸质量浓度C( mg/m L)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准工作曲线。

 31取水解液0.5 m L，稀释500倍，吸取1 m L置于10 m L具-塞试管中，按上述方法处理，在520 nm处测定水解液的吸光度，再根据标准葡萄糖醛酸标准曲线得出水解液中葡萄糖醛酸的含量。

1.2.2红外谱图表征

 采用傅里叶变换红外光谱仪，测定葡萄糖醛酸标准溶液和正交优化条件下得到的水解液。

1.2.3试验方法

 称取制得的氧化淀粉75.0 g置于250 m L三口瓶中，加150 m L水调制成淀粉乳，调节体系pH，加入a-淀粉酶，在一定的温度下水解一定的时间后，再经糖化反应得水解液，按1.2.1测定葡萄糖醛酸含量。研究体系pH、a-淀粉酶加量、酶解温度和时间等对葡萄糖醛酸的影响，在此基础上进行正交试验，确定氧化淀粉的最佳酶解条件。

  2结果与分析

  2.1葡萄糖醛酸的标准曲线的绘制

 按1.2.1进行试验，绘制葡萄糖醛酸的标准曲线。

 图1是以检测得到的葡萄糖醛酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出的葡萄糖醛酸标准曲线，并得到回归方程：A=6.089 29×C+0.112 86。

 R2=0.999 66，线性关系良好。因此，样品中葡萄糖醛酸含量(%)计算公式如下：

2.2水解液的红外表征与分析

按1.2.2进行试验，结果见图2。

 图2为葡萄糖醛酸标准品与水解液中葡萄糖醛酸的红外谱图，水解液、葡萄糖醛酸标准品在3 400cm-1，1700 cm-1处有一个明显的吸收峰，3 400 cm-1为O-H的伸缩振动峰，1700 cm-1为醛类中的C=O伸缩振动峰，说明水解液中含有葡萄糖醛酸。与标准葡萄糖醛酸的红外图谱相比，水解液在1100 cm-1左右出现一个明显的峰，这是因为水解液中同时含有葡萄糖。

2.3 a-淀粉酶加量对水解液中葡萄糖醛酸含量的影响

 取6份75.0 g制得的氧化淀粉置于250 m L三口瓶中，加150 m L水调制成淀粉乳，调节体系pH为6.5，分别加入4，6，8，10，12和14 m L a-淀粉酶，在850C下水解反应60 min，其余按1.2.3进行，研究a-淀粉酶加量与葡萄糖醛酸含量的关系，试验结果如图3所示。

 由图3可以看出：在其它条件不变的情况下，随着a-淀粉酶加量的增加，水解液中葡萄糖醛酸的含量呈先急剧增加，后基本不变的趋势，其原因是，在底物（氧化淀粉）足够时，酶促反应的速度与酶的浓度（加量）成正比，但当酶（a-淀粉酶）的浓度达到一定值后，酶被底物所饱和，酶解反应速度不再随酶浓度的增加而增加。故氧化淀粉水解时a-淀粉酶加量宜为12 m L。

 a-淀粉酶是一种内切淀粉酶，能从非还原性末端随即地切断a-1，4糖苷键，形成三糖（糖酸）、二糖（糖酸）和单糖（糖酸）的混合物。淀粉分子中6-OH的含量约为10%，a-淀粉酶加量为12 m L时，水解液中葡萄糖醛酸的含量为6.98%，其原因是淀粉分子中含有直链淀粉和支链淀粉，支链淀粉是葡萄糖单元通过a-1，6糖苷键结合起来的，且在淀粉氧化过程中，可能发生裂解等副反应或反应不完全，致使水解液中葡萄糖醛酸的含量下降。

2.4酶解温度对水解液中葡萄糖醛酸含量的影响

 取6份75.0 g氧化淀粉置于250 m L三口瓶中，加150 m L水调制成淀粉乳，调节体系pH为6.5，加入12mL a-淀粉酶，分别在65℃，70℃，75℃，80℃，85℃和90℃下水解反应60 min，其余按1.2.3进行，研究酶解温度与葡萄糖醛酸含量的关系，试验结果如图4所示。

  由图4可知，氧化淀粉酶解时a-淀粉酶的最适作用温度为85℃，此时水解液中葡萄糖醛酸的含量为4.99%。其原因是温度对酶促反应有双重影响，一方面，当酶解温度低于最适温度时，随着温度的增加，酶解速度增加，温度每升高10℃，酶促反应会增加1.5～2.5倍。另一方面，a-淀粉酶是一种蛋白质，温度过高，蛋白变性，催化效率下降，酶解反应的速度迅速变慢。

2.5  a-淀粉酶酶解时间对水解液中葡萄糖醛酸含量的影响

  取6份75.0 g氧化淀粉置于250 m L三瓶中，加150 m L水调制成淀粉乳，调节体系pH为为6.5，加入12 m L a-淀粉酶，分别在85℃下分别水解20，30，40，50和60 min，其余按1.2.3进行，研究酶解时间与葡萄糖醛酸含量的关系，试验结果如图5所示。

 由图5可以看出，随着酶解时间的延长，水解液中葡萄糖醛酸的含量呈先增加后基本不变的趋势，其原因是随着反应的进行，底物（氧化淀粉）浓度越来越小，产物（葡萄糖醛酸）浓度越来越大，产物对酶促反应产生竞争性抑制作用，致使反应速度降低，产物浓度基本不变。在其它条件不变的情况下，酶促反应为60 min时，水解液中葡萄糖醛酸的浓度最大为

7.21%。

2.6 pH对水解液中葡萄糖醛酸含量的影响

 取6份75.0 g氧化淀粉置于250 m L三口瓶中，加150 m L水调制成淀粉乳，调节体系pH分别为5.0，5.5，6.0，6.5和7.0，加入12 m L a-淀粉酶，在85℃下分别水解60 min，其余按1.2.3进行，研究体系pH与葡萄糖醛酸含量的关系，试验结果如图6所示。

 由图6可以看出，体系pH对酶促反应速度的影响为一倒钟形曲线，倒钟形曲线的顶点为该反应的最适pH，大于或小于最适pH，反应速度均下降，促反应的最适pH介于6.0～6.5之间。

 高于或低于酶促反应的最适pH，①可能使酶的空间结构破坏，引起酶的活力丧失，这种丧失活力可以是可逆的或者是不可逆的，对可逆的来说，改变pH后可使活力恢复；②影响酶的活性部位催化基团的离解状态，使得底物不能分解成产物；③影响酶的活性部位结合基团的离解状态，使得底物不能和它结合。

2.7正交试验结果

 在单因素试验的基础上，考虑因素之间的相互影响，以a-淀粉酶加量、酶解温度、pH和酶解时间为影响因素，按试验1.2.3进行正交试验。

 由表1可以看出，对水解液中葡萄糖醛酸含量影响的因素依次为：酶加量、pH、酶解温度和酶解时间，正交优化出的水解条件与单因素试验结果一致。再称取氧化淀粉75 g，按照优化的最佳条件进行反应，在pH为6.5，温度为85℃的体系中加人a-淀粉酶12 m L，酶解60 min时，水解液中葡萄糖醛酸的含量最高为9.89%。

3结论

 采用单因素和正交试验法确定了葡萄糖醛酸制备工艺中的最佳酶解条件，研究发现在体系pH为6.5，酶解温度为85℃，加入12 m L a-淀粉酶后酶解60 min时，水解液中葡萄糖醛酸含量最高，可达到9.89%。