王陶，李文，董玉玮，高明侠，李同祥*

  徐州工程学院，江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室（徐州221008）

摘要单胃动物不能有效利用植物性饲料中的磷，因为磷主要以植酸磷的形式存在。通常通过在饲料中添加植酸酶，水解植酸脱磷，来提高动物对磷的利用率。利用黑曲霉发酵产生的植酸酶粗酶液对豆粕中的植酸进行脱磷作用研究。通过单因素试验和正交试验确定植酸酶水解豆粕中植酸的最适条件为：酶加量为600 U/g，底物浓度为60 mg/m L, pH为4，温度为55C,脱去无机磷的量为4.127 mg/g。最优条件下，豆粕中植酸水解5 h后的水解率为87.34%。

关键词  黑曲霉；植酸酶；豆粕；脱磷

  植酸酶( Phytases)是水解植酸（肌醇六磷酸）或植酸盐一类酶的总称，广泛存在于微生物中。细菌、酵母菌、霉菌和多种多细胞真菌均能产生植酸酶，其产植酸酶的性质各异。根据最适pH的不同，植酸酶可分为酸性植酸酶、中性植酸酶和碱性植酸酶，而微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入。植酸酶可以提高饲料中磷的利用率，解除饲料中抗营养因子，提高饲料中营养物质的利用率，降低动物粪便中磷的含量，减少对周围环境的污染，提高饲料干物质的表观消化率和存留率，植酸酶还可以提高氨基酸和氮的表观消化率。鉴于植酸酶的广泛作用，已经成为酶制剂和饲料添加剂研究热点。目前，植酸酶广泛应用于食品工业和饲料工业中，它能使植物性饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，从而减少饲料中磷的添加量，降低对环境污染；它还可破坏植物性饲料或食品中植酸与矿物元素及蛋白质的亲和力，提高矿物元素生物利用率和蛋白质的消化率，从而提高食品的营养价值和畜牧生产效益。

 豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，豆粕中富含高质量的植物性蛋白质、微量矿物元素和维生素，成为优良的植物蛋白来源。作为一种高蛋白质，豆粕是制作牲畜与家禽饲料的主要原料。植酸酶作为单胃动物饲料添加剂的饲喂效果已被充分证明与肯定。在以玉米、豆粕和麸皮为主要成分动物饲料中，磷的吸收率只有15%，添加植酸酶后，植酸磷的利用率一般提高20%～50%;另外，在饲料中添加植酸酶一般可降低畜禽粪便中20%～50%的磷。所以，以植酸酶代替部分或全部的磷酸氢钙，无论是提高饲料中磷的利用率、减轻对环境的污染，还是提高养殖的安全性都有着重要的意义。试验利用筛选到的黑曲霉高产植酸酶菌株进行发酵得到植酸酶粗酶液水解豆粕中的植酸，从而得到植酸酶脱磷的最适条件，为进一步开发利用黑曲霉植酸酶提供一定理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

 黑曲霉由徐州工程学院微生物遗传育种实验室保存；植酸钠（高纯试剂）：美国Sigma公司；偏钒酸铵（分析纯）：合肥工业大学化学试剂厂；四水合钼酸铵（分析纯）：合肥工业大学化学试剂厂；三氯乙酸（分析纯）：天津市河东区红岩试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

 TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；HYG旋式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；DL-5低速大容量离心机：常州国华电器有限公司。

1.3培养基

  斜面培养基：马铃薯150 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L。

 产酶培养基：麸皮3%，(NH4)2SO45g/L，蛋白胨3 g/L, KC1 0.5 g/L,  MgSO4. 7H2O0.5 g/L,  MnSO4.H2O0.018 g/L,  FeSO4. 7H20 0.03 g/L,  pH 5.5。

  麸皮在烧杯里加水在电炉上煮沸后，再煮10 min左右，用纱布过滤，取滤液。再加其他成分，最后补足水分。

1.4方法

1.4.1斜面活化

 选用冰箱保藏的黑曲霉菌株进行斜面活化，恒温箱中28℃培养3d，观察生长情况。

1.4.2液体发酵及粗酶液的制备

 活化好的黑曲霉菌株转接至产酶培养基摇床发酵产酶，装液量100 m L（250 m L三角瓶），150 r/min．28 ℃培养84 h。发酵结束后，静置10 min，往10 m L的离心管中加入5 m L的上清液，放人的低速离心机中，以4 000 r/min的速度将发酵液离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.4.3植酸酶活测定

 将4.0 m mol/L磷酸二氢钾标准溶液稀释成0.0，0.8，1.6，2.4，3.2和4.0 m mol/L的溶液。用移液管分别量取2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 m L的4.0 m mol/L磷酸二氢钾标准溶液于5个10.0 m L容量瓶，用乙酸缓冲溶液将其定容并且摇匀。

 以无机磷浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。列出直线回归方程为y=0.002 6x-0.002 4，相关系数R2=0.997 9。

 酶活单位定义：以37℃，pH 5.5条件下，1 min从5.0 m mol/L植酸钠溶液中水解释放1μLmol无机磷所需要的酶量定义为一个酶活单位，以U表示。

  对照标准曲线计算其酶活，见式(1)。

1.4.4无机磷浓度的测定

 采用Harland等的微量比色法定磷，略有改动。

1.4.4.1工作曲线的绘制

  分别取0.00，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00．10.00, 12.00和15.00 m L磷标准溶液于50 m L容量瓶中，各加入钒钼酸铵显色剂10 m L，用水稀释至刻度，摇匀，室温下放置10 min以上，以试剂空白为参比，用1 cm比色池在420 nm下测定各溶液的吸光度，以无机磷含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制工作曲线，如图2。直线回归方程为y=0.051 0x+0.004 8．R2=0.998 9。

1.4.4.2测定总磷和无机磷样品的处理

 总磷：准确称取试样2～5 g于坩埚中，在电炉上小心炭化，再放人马弗炉中，在550℃灼烧3h，取出冷却，加入10 m L盐酸溶液和硝酸数滴，小心煮沸数分钟，冷却后转入100 m L容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，过滤弃去初始的20 m L滤液，为试样分解液。

 无机磷：准确称取试样2～5 g置于100 m L烧杯中，加10 m L盐酸溶液和硝酸数滴，加水30 m L，搅拌数分钟，然后定量转入100 m L容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，过滤弃去初始的20 m L滤液，为试样分解液。

1.4.4.3分解液和经粗酶液浸泡的豆粕上清液中磷的测定

 准确吸取滤液或粗酶液浸泡的豆粕上清液2 m L于50 m L容量瓶中，加钒钼酸铵显色剂10 m L，用水稀释至刻度，摇匀，室温下放置10 min，按上述方法测定其吸光度。

磷含量计算公式，见式(2)。

1.4.5脱磷条件的优化

  将植酸酶粗酶液加入豆粕中，水解豆粕中的磷酸。基础条件为：在pH为5，温度为45℃，底物浓度为50 mg/m L，水解时间为4h。

 1)加酶量对无机磷含量的影响：将粗酶液加入豆粕中，考察加酶量分别为200，400，600，800和1000U/g时对麸皮上清液中无机磷量的影响，确定最佳加酶量。

 2)底物质量浓度对无机磷含量的影响：在最佳酶量下，分别考察豆粕浓度40，50，60，80和100 mg/m L时对无机磷量的影响，确定最佳底物质量浓度。

 3)温度对无机磷含量的影响：采用最佳酶量和底物质量浓度，分别考察温度25℃，37℃，45 ℃，50℃和55℃时对磷量的影响，确定最佳酶解温度。

  4) pH对无机磷含量的影响：采用最佳酶量、底物质量浓度和温度，分别考察pH 3，4，5，6和7时对无机磷量的影响，确定最佳pH。

  5)正交试验：结合前面的单因素试验，以加酶量、底物质量浓度、温度和pH为影响因素，选用L9(34)正交表进行试验，确定最佳组合。

1.4.6最优条件下豆粕中磷释放量随时间的关系

 采用正交试验得到最佳的酶加量、底物浓度、水浴温度和pH，分别考察水解1，2，3，4，5和6h上清液中磷含量的变化情况。

 再考察不加酶液，其他因素采用最优条件，分别在水中浸泡1，2，3，4，5和6h后上清液中磷含量的变化情况。

 植酸磷的降解率=豆粕中已降解植酸磷量／豆粕中总植酸磷量×100% (3)

2结果与分析

2.1脱磷条件的单因素优化

2.1.1  加酶量对脱磷作用的影响

 在pH为5，温度为45℃，底物浓度为50 mg/m L，水解时间为4h，不同黑曲霉植酸酶酶加量对豆粕中植酸的脱磷作用如图3所示。

 由图3可以看出，在加酶量不断增加的情况下，植酸酶的脱磷效果也不断提高，最后趋于平稳，可能是由于底物已经达到饱和，再增加酶量对其磷的释放没有影响。当酶加量在600～1 000 U/g时磷量增加非常小，考虑利用率和经济适用，所以选择酶加量为600 U/g进行以下条件的优化选择。此时，磷的释放量达到最大，为3.379 mg/m L。

2.1.2不同底物浓度对无机磷含量的影响

 在pH为5，温度为45℃，酶加量为600 U/g，水解时间为4h，不同底物浓度脱去豆粕中磷量如图4所示。

 由图4可知，磷释放量随底物浓度的增加呈先上升后趋于平稳的趋势，底物浓度为60 mg/m L时脱磷效果最佳，对豆粕的脱磷量达到最大3.627 mg/g。底物浓度超过60 mg/m L后，磷释放量趋于平缓。若底物浓度加大，植酸酶将达到饱和，不会把所有豆粕中的植酸磷水解，使得磷释放量最后变化不大。因此，最佳底物质量浓度为60 mg/m L。

2.1.3不同温度对无机磷含量的影响

  在pH为5，酶加量为600 U/g，底物浓度为60 mg/m L，水解时间为4h，不同温度情况下脱去豆粕中磷量如图5所示。

 由图5可知，磷释放量随温度的增加呈先上升后下降的趋势。当温度达到50 0C时对豆粕的脱磷效果最好，脱磷量达到3.724 mg/g。在37 0C（人体温度）时，植酸酶的脱磷效果不是最好，若要更好的利用磷，应在动物进食之前以高于动物体温的酶液浸泡饲料（豆粕等）。另外，温度太高也会使酶失去活性，所以也不适宜将酶加入较高温度的水中。

2.1.4不同pH对无机磷含量的影响

  在酶加量为600 U/g，底物浓度为60 mg/m L，温度为50℃，水解时间为4h，不同pH时脱去豆粕中磷量如图6所示。

  由图6可知，磷释放量随pH增加呈先上升后下降的趋势。当pH 5时植酸酶脱磷效果最好，脱磷达到3.495 mg/g。随着pH的增加，pH过高过低，植酸酶会变性，因此其酶活会呈先上升后下降的的趋势。植酸酶的酶活直接决定酶解豆粕中植酸的能力，所以磷释放量是随pH的上升呈先上升后下降。

2.2正交试验确定脱磷作用的最优条件

 结合前面的单因素试验得到的结论，分别选取不同粗酶液加量、底物浓度、pH和温度为影响因素，进行L9(34)正交表进行试验。

 表1表明黑曲霉植酸酶水解豆粕中植酸4个因素中，影响程度大小依次为D、B、A和C，最优组合为A2B2C1D3；而正交试验组合中植酸酶水解植酸能力最好的为A3B2C1D3，故需进行验证试验以确定最优组合。

 比较A2B2C1D3和A3B2C1D3两种条件下的脱磷效果。试验数据结果如表2所示。

 由表2验证试验可得，当酶加量为600 U/g，底物浓度为60 mg/m L，pH 4，温度为55 0C时，即组合A3B2C1D3，植酸酶有最优的脱磷作用，此时脱去无机磷的量为4.127 mg/g。

2.3最优条件下考察磷释放量随时间的关系

 分别用酶液和水浸泡豆粕考察磷释放随时间的变化情况，其结果见图7所示。

 由图7可以看出，常温水浸泡豆粕无机磷的释放量几乎不变，平均为0.51 mg/g。当酶液浸泡时间达5h，磷释放量将不会明显增加。磷释放量随时间的增加呈先上升后平稳的趋势。随时间的增加，豆粕中植酸磷不断被水解出来，最后所有磷全被水解出来，最大水解磷量为4.187 mg/g。

  试验测得豆粕中总磷、无机磷和植酸磷的数据如表3所示。

 所以5h豆粕中植酸的水解率为：(4.187-0.51)／4.21×100%=87.34%。豆粕中植酸磷与总磷的比例达到67%，通过水解无机磷总量将从33%提高到90%以上，在动物饲料中加入植酸酶有利于动物对磷的吸收。

3结论

 试验利用诱变选育得到的高产植酸酶黑曲霉菌株发酵得到的植酸酶粗酶液水解豆粕中的植酸，研究其脱磷的最佳作用条件。通过单因素试验和正交试验，得到植酸酶水解豆粕中植酸的最优条件为：酶加量为160 U，底物浓度为60 mg/m L，pH为4，温度为55℃。在反应5h以后无机磷的量相对于水浸泡所得磷增加较多。试验测得植酸磷含量为4.21 mg/g，最优条件下豆粕中植酸酶的水解率为87.34%。

 为了进一步提高植酸酶的产量，可以采用基因工程菌的方法，同时为了避免饲料制粒过程中的高温对酶活的不利影响，下一步可对黑曲霉菌株进行遗传改良，增强对热的耐受性，进一步拓宽其应用范围。