罗李王，杨最素，张亚茹，王飞，余方苗*，丁国芳

 浙江海洋学院食品与医药学院，浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心（舟山316022）

摘要研究酶解青蛤制备血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制肽。以ACE抑制率为指标，先筛选最适酶种；探究温度、时间、pH、加酶量和料液比等因素对ACE活性的影响，通过L16(45)正交试验优化酶解工艺。结果表明，最适酶为胰蛋白酶，最佳制备工艺条件为：反应温度45℃，反应时间9h，pH 8.0，加酶量1 200U/g，料液比为1：2(g/mL)。最佳工艺所得酶解物的ACE抑制率为36.8%。为青蛤的高值化利用提供了理论依据。

关键词  青蛤；酶解；血管紧张素转化酶抑制肽；单因素试验；正交试验

  高血压是困扰当今的一种心血管疾病，可导致严重的并发症，对人类健康危害极大。血管紧张素转化酶( Angiotensln-converting enzyme，ACE)在机体血压调节过程中起重要作用，一方面ACE将无活性的血管紧张素I转化为具有强烈收缩全身微动脉，使血压升高的血管紧张素Ⅱ；另一方面ACE能促进有降血压作用的缓激肽分解，引起血压升高。现今人工合成的卡托普利、依那普利和赖诺普利等ACE抑制剂，这些药物具有很强的降血压作用，但长期服用会产生眩晕、恶心、剧烈咳嗽、味觉异常和肾功能损害等副作用。因此，开发既有较好ACE抑制活性且安全无毒副作用的产品成为研究的热点。

 近年来，研究者将目光投向了包括海洋贝类、鱼类以及海产品加工下脚料等海洋蛋白为原料制备ACE抑制肽，并取得了一定的进展。目前，已经成功的从贻贝、四角蛤蜊、墨鱼肌肉、鳕鱼皮、金枪鱼骨和灰鳐皮等海洋蛋白中制备分离出高活性的ACE抑制肽。

 青蛤（Cyclina sinensis）是我国沿海常见的贝类，属软体动物门、双壳钢、帘蛤目、帘蛤科。青蛤提取物具有抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫作用等功效。目前尚鲜见与青蛤降血压肽相关的研究报道，试验在单因素试验的基础上，采用正交试验对胰蛋白酶水解青蛤制备ACE抑制肽的工艺进行优化。为进一步从青蛤中制备、分离纯化得到高活性的抑制肽做准备。

1  材料与方法

1.1原料

  青蛤：市售，并经浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定。

1.2试剂

 马尿酸、马尿酰-组氨酰-亮氨酸( HHL)和血管紧张素转化酶（源于兔肺）：Sigma公司；乙腈、甲醇：色谱纯；三氟乙酸、硼酸、硼砂、氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶：亚太恒信生物科技有限公司。

1.3仪器与设备

 Agilent-1260型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；Milli-A20型超纯水系统：美国默克密理博公司；AUW-120型电子天平：日本岛津（上海）有限公司；Delta-320型pH计：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；HH-6型恒温水浴锅：金坛市成辉仪器有限公司；CF16RN型高速冷冻离心机：日立仪器有限公司。

1.4试验方法

1.4.1青蛤ACE抑制肽制备工艺流程

1.4.2青蛤预处理

 将青蛤除壳，剥肉，再用清水把蛤肉洗干净，经高速组织搅碎机匀浆( 10 000 r/min，5 min)。用0.1 mol/L的NaOH浸泡青蛤肉3h，脱杂蛋白和除去脂质，试验重复2次，最后用纱布滤去NaOH，纯水泡洗滤渣（直至中性），滤渣脱水-20℃冷冻备用。

1.4.3高效液相色谱(HPLC)法测ACE抑制活性

 参HaShanguang Wu等旧的方法，并根据试验的具体情况稍作修改。试验在1.5 mL的离心管中进行，取浓度为5 mmol/L的HHL溶液120μL，加入20 μL抑制剂(1 mg/mL)，混合均匀，在37 0C恒温水浴中预热5 min，然后加入10μL ACE( 0.1 U/mL)溶液，混合均匀，在37℃恒温水浴1h，最后加入150μL HC1(1 mol/L)终止反应，得到抑制剂反应液。所得样品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，进样到液相系统。同时用20μL硼酸缓冲盐溶液（0.1 moI/L，pH 8.3，含0.3mol/L NaCl）替代抑制剂溶液作空白对照组。

ACE抑制活性计算公式为：

1.4.4酶解方法

 称取预处理的青蛤肉( 10 g)，以胰蛋白酶为例，在温度为50℃、pH 8.0、加酶量为1 000 U/g、料液比1：3( g/mL)时酶解反应6h，用0.5 moI/L Na OH溶液或0.5 mol/L HC1调节pH至酶解条件，水解过程中不断搅拌，并维持pH在规定的范围内(±0.05)，反应完成后于沸水浴灭活15 min，冷却后于4℃．10 000 r/min预冷的离心机离心15 min，上清液冷冻干燥后备用，测其ACE抑制活性。

1.4.5酶解工艺优化

 先通过选酶单因素试验筛选最佳酶，再做温度、时间、pH、加酶量和料液比等单因素试验，选取合理因素水平，最后通过L16(45)正交试验优化酶解青蛤制备ACE抑制肽工艺。

2结果与分析

2.1筛选最佳酶

 称5份10 g预处理的青蛤肉，分别用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，按照各蛋白酶的最适作用温度和pH（见表1），参照1.4.3的酶解方法进行酶解，以ACE抑制率作为评价指标，结果见图1。

 由图1可知，在所选的5种蛋白酶中，胃蛋白酶酶解物的ACE抑制活性最弱；碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解物的ACE抑制活性一般；胰蛋白酶酶解物的ACE抑制活性最强，抑制率为32.8%；由于这五种蛋白酶的作用方式和酶切位点均不相同，所以作用于同一底物后，得到的酶解产物也不同。因此，试验对胰蛋白酶酶解青蛤制备ACE抑制肽的条件进行优化。

2.2胰蛋白酶解单因素试验

2.2.1  温度单因素试验

 分别称5份10 g预处理的青蛤肉，调节pH至8.0，加酶量为1 000 U/g，料液比为1：3(g/mL)，在不同温度下（40℃, 45℃，50 ℃，55 ℃和60℃）酶解6h。结果如图2所示。

 从图2可以看出，在酶解过程中，适当的提高温度可增加酶解产物对ACE的抑制活性；在50℃时酶解产物对ACE的抑制活性达到峰值，抑制率为32.44%：温度大于50℃时，酶解产物的ACE抑制活性开始减弱。综合考虑后，酶解温度选择400C～55 0C的水平做正交试验。

2.2.2时间单因素试验

 分别称5份10 g预处理的青蛤肉，料液比为1：3( g/m L)，加酶量为1 000 U/g，反应pH为8.0，50℃恒温酶解（2，4，6，8和10 h）。结果如图3所示。

 从图3可以看出，随反应时间适当延长酶解产物对ACE抑制活性逐渐上升，酶解反应时间为8h时酶解产物对ACE抑制活性达到峰值，抑制率为32.66%。随酶解时间的增加，活性肽段逐渐被释放，但酶解时间过长会使目的产物被降解，造成ACE抑制活性下降。综合考虑后，酶解时间选择7～10 h的水平做正交试验。

2.2.3 pH单因试验

 分别称5份10 g预处理的青蛤肉，加酶量为1 000U/g，反应温度为50 0C，料液比为1：3(g/m L)，在不同pH（6，7，8，9和10）下酶解6h。结果如图4所示。

 从图4可以看出，在pH为6～10时，随反应pH的增大酶解产物对ACE抑制活性先升后降。酶有最佳酶解pH，过酸或过碱都会影响酶的活性。pH为8时酶解产物对ACE抑制活性达到峰值，抑制率为33.65%。综合考虑后，酶解pH选择6～9的水平做正交试验。

2.2.4加酶量单因素试验

 分别称5份10 g预处理的青蛤肉，调节pH至8.0，在加酶量为（300，600，900，1 200和1 500 U/g）的条件下，50℃恒温酶解6 h。结果如图5所示。

 从图5可以看出，在酶解的过程中随着加酶量的增加酶解产物对ACE抑制率逐渐上升，在600～900 U/g之间，增幅较大，此后随加酶量的增加，ACE抑制率增幅较小，这种现象可能是酶浓度达到了饱和状态。当加酶量为1 500 U/g时，酶解物的ACE抑制活性最强，抑制率为30.2%。随着加酶量的增加，酶解的不良气味加重，综合考虑后，加酶量选择800～1 400 U/g的水平做正交试验。

2.2.5料液比单因素试验

 分别称5份10 g预处理的青蛤肉，调节pH至8.0，加酶量为1 000 U/g，在不同的料液比(1:1，1：2，1：3，1：4和1：5(g/m L))的条件下，50℃恒温酶解6h。结果如图6所示。

 从图6可以看出，在酶解的过程中随着料液比的增加酶解产物对ACE抑制率先升后降再升；在料液比为1：2( g/m L)时，酶解产物对ACE抑制活性达到峰值，抑制率为34.21%。综合考虑后，料液比选择1：2～1：5(g/m L)的水平做正交试验。

2.3胰蛋白酶解正交试验

2.3.1正交试验因素水平的选取

 在单因素试验的基础上，获得较好的试验参数范围后，综合考虑各因素之间的相互影响，选择酶解温度、加酶量、pH、时间和料液比5个因素进行优化，每个因素4AI水平。试验因素和水平设计见表2。

2.3.2正交试验设计及结果

  选择各单因素的合理水平做L16(45)正交试验，以确定胰蛋白酶酶解青蛤制备ACE抑制肽的最佳条件。L16(45)正交试验的结果如表3。

  由表3结果作极差分析可知，5个因素的极差大小为：A>C>B>E>D。即反应过程中以料液比影响最大，其次为加酶量、pH、时间，最后为温度。根据极差大小可知最优组合为A1C3B3E3D2，即料液比为1：2( g/mL)，加酶量为1 200 U/g，pH为8.0，反应时间为9 h，反应温度为45℃。在此条件下进行验证，酶解产物对ACE的抑制率36.8%，为最优试验结果。

3结论

 以青蛤为原料酶解法制备ACE抑制肽。以ACE抑制活性为指标，先筛选最适酶种，确定最适酶为胰蛋白酶。在温度、时间、pH、加酶量和料液比单因素试验的基础上通过L16(45)正交试验优化酶解工艺。最佳制备工艺条件：料液比1:2（g/m L），加酶量1 200U/g，pH 8.0，反应时间9h，反应温度为45 0C，最佳工艺下酶解物的ACE抑制率为36.8%。该工艺为进一步试验提供了基础，也为开发海洋生物酶解制备ACE抑制肽提供思路。