苏艳玲，韩红艳，杨艳君

 晋中学院生物科学与技术学院（晋中030600）

摘要  以苦杏仁为研究材料，展开杏仁凝集素提取条件优化的试验，并对部分性质进行研究。结果表明，杏仁凝集素粗提液对人B型血的血凝效果较好：浸提液PBS+CaCl2的凝集活性最高；采用均匀设计的方法优化杏仁凝集素的提取工艺，得到回归方程为：Y=0.162 1+0.139 0X1-0.016 44X12+0.015 96X2X3，最佳组合为：X1（时间）20.65 h，X2（料液比）1：13 (g/m L), X3（饱和硫酸铵质量分数）80%，理论凝集活性为0．854 6．经验证试验得到杏仁凝集素粗蛋白的凝集活性为0.685 4。杏仁凝集素具有双糖和糖衍生物的专一性，而没有单糖的专一性；pH在4.5～9.5，温度30℃～50℃时具有较高的活性。

关键词  杏仁；凝集素；血凝活性

  凝集素是一种具有能与不同种类糖残基可逆结合位点的非免疫源性的蛋白质或糖蛋白，广泛分布于植物的种子、根、茎、叶、皮和果实等各种组织器官中。凝集素最典型的特征是能与红细胞表面特异糖基发生专一性结合，直观的表现为使红细胞发生凝集，除此之外，在抑制肿瘤细胞增殖、转基因抗虫和防御病原体侵入等医药和农业领域也取得了一定的功效。目前研究得最为清楚的凝集素家族是豆科凝集素，唐超研究了黑豆凝集素的提取条件，以鸡血检测凝集效价，得出用PBS浸提的提取率最高  为9.17%；赵则海提取了四棱豆叶中的凝集素，指出血凝效果评价准确性上凝集活性( Aa)高于凝集效价，且提取液中蛋白质含量与凝集活性之间有显著相关性；刘超研究了不同理化因素对白芸豆凝集素的影响，得出白芸豆凝集素具有较强的耐热和耐酸碱能力，依赖Mn2维持凝血活性，对盐酸胍、脲和SDS具有较强的稳定性。凝集素作为当今研究的热点之一在其他植物的种子、叶片和果实上也进行了大量的研究，如花生、核桃和苦荞等，但是有关杏仁中凝集素的提取及凝血作用等研究报道鲜见。

 杏仁是蔷薇科杏属植物的种子，分为甜杏仁和苦杏仁两种，其营养价值很高，尤其是蛋白质含量(25%)仅次于大豆蛋白。随着人们健康意识的增强，结合杏仁良好的医疗效用，很多学者开展了杏仁蛋白的研究，其中杏仁多肽因具有抗氧化、降血压和增强免疫等特殊生理功能而成为研究的热点。但有关杏仁中的更多生物活性成分，包括凝集素及其在植物源凝集素中的分类、功能等的研究还有待揭示。试验首次用均匀设计法优化了杏仁凝集素( Almondlectin, AL)粗蛋白的提取工艺，并对其性质进行了初步研究，为今后杏仁凝集素生物学功能及应用的深入研究提供一定的基础。

  1材料与方法

  1.1试验材料

 苦杏仁：市售。

 不同血型（A、B、AB和O）的人血，用浅蓝色头盖的枸橼酸钠凝血试验管采集于晋中市四处医院化验科。

1.2试验仪器与试剂

 OHG-907835-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；FA1004电子天平：上海精科天平；EU-2600R型紫外可见分光光度计：上海昂拉仪器有限公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ型离心机：上海安亭科学仪器厂生产；DS-1型组织捣碎机：金坛市水北科普实验仪器厂。

 考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢纳、肝素钠、氯化钠、硫酸铵、氯化镁、氯化钡：分析纯试剂，天津市天大化学试剂厂；标准牛血清白蛋白：北京奥博星生物科技有限责任公司。

1.3试验方法

1.3.1杏仁凝集素粗提液的制备

 选取颗粒饱满的杏仁10 g，温水浸泡去皮，于400C烘干后用组织捣碎机粉碎，经索氏提取器抽提16 h脱脂后取出置于培养皿中在通风橱中晾干。称取样品3g，按照物料比1:7（g/m L）加入浸提液，搅拌后置于4℃冰箱中浸提。之后于12 000×g离心30 min，弃去沉淀在上清液中加入硫酸铵进行盐析，并于4℃条件下浸泡24 h．12 000×g离心40 min，弃上清液，将离心后的沉淀装透析袋在PBS溶液中透析12 h，然后换成蒸馏水透析除盐5～6 h，用0.1 mol/L的BaCI2溶液检测直至无白色沉淀为止，12 000×g离心30 min，去除不溶性物质即为杏仁凝集素粗提液。

  1.3.2 2%血细胞悬液的制备

 人的A、B、O和AB型血样用稀的PBS溶液漂洗4～6次，每次1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用PBS溶液配成2%的PBS-红细胞的悬浮液。

1.3.3杏仁凝集素凝血活性的测定

 用96孔V板以倍比稀释法测定凝血活性。用微量移液器在96微孔板各排第一孔和第二孔中加入25μL凝集素，再取25μ L PBS缓冲液加入第二孔，混匀后亦取出25 μL加入第三孔，按此方法倍比稀释到第12个孔，混匀后吸取25μL弃掉，再在每孔中加入25μL红细胞悬液，室温条件下放置30 min，观察凝集效果，若没有凝集，则红细胞在底部形成一个光滑的小圆点；若发生凝集，则红细胞呈散落状分布。以2n表示凝集效价，即杏仁凝集素能使红细胞发生凝集反应的最大稀释倍数，对其进行量化，其加权平均数作为量化的凝集活性( Agglutinating activity，A a)，见表1。

1.3.4杏仁凝集素粗提液的血细胞凝集活性分析

 采用0.2 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)按照杏仁凝集素粗提液制备的方法提取杏仁凝集素，研究其对人不同血型的血细胞凝集活性。

1.3.5最佳浸提缓冲液的确定

 采用0.2 mol/L pH 7.4 PBS、蒸馏水、0.9%生理盐水、PBS+0.01 mol/L CaCl2和PBS+0.01 mol/L MgCl2五种不同的浸提液在相同的条件下进行浸提，通过测定提取液对人B型血的凝集活性，确定最佳的浸提溶液。

1.3.6杏仁凝集素最佳提取条件的优化

采用均匀设计L9(53)优化杏仁凝集素粗蛋白提取工艺。试验选取浸提时间、料液比和饱和硫酸铵浓度3因素，根据试验因子选取均匀设计使用表，见表2。

1.3.7杏仁凝集素的性质

1.3.7.1糖专一性

 将葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、a-果糖、a-甘露糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺溶解于PBS缓冲液中，配置成0.1 mol/L的糖溶液，取杏仁凝集素粗提液按照倍比稀释法加在96孔V型板上，之后加入等体积分数的2%的B型血细胞悬液，于37 ℃水浴中反应30 min，测定凝集效价㈣。

1.3.7.2 pH稳定性

 用PBS+CaCl2缓冲液将杏仁凝集素pH调到4.5，5.5，6.5，7.5，8.5和9.5，搅拌透析2h，加入等体积分-数2%的B型血细胞悬浮液进行凝集效价的测定。

1.3.7.3温度稳定性

 杏仁凝集素粗提样品在温度为30 ℃，40℃，50℃ , 60℃，70℃，80℃，90℃和100℃的恒温水浴中保温10 min后冷却至25℃，加入等体积分数2%的B型血细胞悬浮液进行凝集效价的测定。

1.4数据分析

 采用DPS 7.05对数据进行分析

2结果与分析

2.1杏仁凝集素粗提液血细胞凝集活性的分析

 按照1.3.1的方法提取杏仁凝集素粗提液，研究其对人不同血型的血细胞凝集活性的结果，见表3。

 由表3可知，杏仁凝集素粗提液对B型血的凝集效果最好，稀释至27仍有活性，其次对O型血的凝集效果好，其他两种血型的凝集效果不好，尤其是A型血，因此，试验选择B型血作为杏仁凝集素提取工艺优化的供试血型。

2.2最佳浸提缓冲液的选择

 在浸提时间15 h，料液比1：7(g/m L)，70%饱和硫酸铵质量分数沉淀下，研究不同的浸提液对杏仁凝集素的凝集活性，结果见图1。

 由图1可知，不同浸提剂提取杏仁凝集素的凝集活性大小为：PBS+CaCl2>PBS+MgCl2>PBS >0.9%生理盐水>蒸馏水，因此，试验选取PBS+CaCl2作为杏仁凝集素浸提的缓冲液。

2.3均匀设计提取工艺的结果

杏仁凝集素粗蛋白提取的均匀试验结果见表4。

 通过DPS 7.05软件进行多元回归模型的建立，采用二次多项式逐步回归分析，获得提取杏仁蛋白的回

 回归方程的相关系数R=0.998 9，F=149.99(p：0.059 9<0.1)，Durbin-Watson统计量d=1.87，

接近2，对回归方程进行通径分析，决定系数=0.997 78，剩余通径系数=0.047 09，说明通径分析成立。综合分析结果表明，回归方程可以反映多元线性回归模型，回归分析有效。

 由表5可知，X1（时间）对杏仁凝集素粗蛋白提取有显著影响，X2（料液比）和X3（饱和硫酸铵质量）未列入方程，说明它们两个因子在试验设置的范围内对杏仁凝集素粗蛋白提取并没有显著影响，但是X2（料液比）与X3（饱和硫酸铵质量）交互项对杏仁凝集素粗蛋白提取的影响达到显著水平，且两者呈正相关。

2.4杏仁凝集素粗蛋白最佳提取条件的验证试验

 对方回归程进行模拟寻优，得到了杏仁凝集素粗蛋白提取的最佳组合为X1=4.13，X2=5，X3=5，即时间20.65 h，料液比1：13( g/m L)，饱和硫酸铵质量分数80%，此时的理论凝集活性为0.854 6。根据优化后的条件提取杏仁凝集素粗蛋白，凝集活性为0.685 4，与回归方程的结果相近，说明该方程可用于杏仁凝集素粗蛋白凝集活性的分析，进一步验证了该方程的有效性。

2.5杏仁凝集素的性质

2.5.1糖专一性

  杏仁凝集素粗提液对7种糖的专一性结果见表6。

  由表6可知，试验中所选的3种单糖对杏仁凝集素的抑制作用不敏感，双糖和乙酰化的糖链有抑制作用，且麦芽糖的抑制作用效果最明显，高于乳糖和蔗糖，说明杏仁凝集素分子中含有这些糖互补的结合位点。不同的凝集素与糖的特异性结合是不同的，花生种子凝集活性可被乳糖、蜜二糖、棉籽糖和D-半乳糖四种糖所抑制，核桃凝集活性可被糖的衍生物所抑制，但不能被常见的单糖和寡糖抑制，龙须菜凝集活性会被D-木糖、D-果糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖及乳糖抑制，凝集素是否与单糖或双糖结合可能与分子量大小和浓度有一定的关系。

2.5.2 pH稳定性

  杏仁凝集素粗提液对pH稳定性结果见表7。

  由表7可知，杏仁凝集素在pH 6.5左右的凝集效价较高，在酸和碱性的条件下仍然表现出一定的凝集效价，说明该凝集素对pH的适应范围较广，能进行一定的凝集反应。

2.5.3温度稳定性

  杏仁凝集素粗提液对温度稳定性结果见表8。

  由表8看出，杏仁凝集索有广泛的热稳定性，在30℃～80℃都表现出一定的凝集效价，且温度在30℃～50℃时凝集效价较高，之后随着温度的升高，凝集效价降低，到90℃无凝集作用。

3结论

  1)杏仁凝集素粗提液对人B型血的血凝效果较好；浸提液PBS+CaCl2的凝集活性最高。

  2)采用均匀设计的方法优化杏仁凝集素的提取工艺，建立了多元回归模型，得到回归方程为：

  3)杏仁凝集素具有双糖（麦芽糖、乳糖及蔗糖）和乙酰化糖链（N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰神经酰胺）的专一性，而没有单糖的专一性；pH的适应范围较广(4.5~9.5)，温度在30℃~50℃时凝集效价较高。