谭丽娟1，金学俊1，2，李官浩1，金清1，崔福顺1*

 1．延边大学农学院（延吉133002）；2．延边州疾病预防控制中心（延吉133000）

摘要对人参茎叶提取液盐酸水解前后的抗氧化活性进行了比较。以DPPH．、羟自由基、超氧阴离子及ABTS+．的清除率、还原能力评价抗氧化活性。结果表明经盐酸水解后的人参茎叶水解液对DPPH自由基清除率由75.08%提高至85 .12%，羟自由基清除率由43.87%提高至77.90%，超氧阴离子清除率由77.48%提高至90.09%,ABTS+.清除率由83.40%下降至50.89%，还原能力由55.41%下降至24.48%。结果说明盐酸水解前后的人参茎叶提取液和水解液均有很好的抗氧化作用。

关键词人参茎叶；酸水解；抗氧化

 人参是五加科人参属植物，为名贵中药，主要分布于我国吉林、辽宁、黑龙江等省。《神农本草经》记载的人参药用部分主要为地下部分，即人参的根和须。现代研究发现，人参地上部分如花、果、茎叶中含有与地下部分相同的功效成分，有些成分的含量比地下部分还要高。目前已从人参茎叶中得到皂苷类、黄酮类、多酚类、多糖类等功效成份。人参茎叶中含有的黄酮类主要为人参黄酮苷、山柰酚及槲皮素等。黄酮类化合物广泛存在于植物中，是植物次生代谢产物，具有抗疲劳、抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化等作用。黄酮类化合物多与糖结合形成黄酮糖苷，只有极少数以苷元形式存在。近代研究发现，黄酮苷元清除自由基的活性明显高于黄酮糖苷，效价是黄酮糖苷的7倍。

  吉林省是人参生产大省，栽培量占全国总产量的56%，每年可生产人参茎叶5 000 t。前期研究发现，人参茎叶乙醇提取液中含有丰富的芦丁，提取液经盐酸水解后芦丁几乎全部转化为黄酮苷元山柰酚，转化率达96%。因此，通过对人参茎叶转化前后提取液的抗氧化性比较，为人参资源的综合开发利用提供理论基础。

1  材料与方法

1.1仪器和试剂

 UV-7504型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；2400 K离心机：德国哈默；KQ-500型医用数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LGJ-12冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；101型电热恒温鼓风干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司。

  人参茎叶：汪清县；芦丁：上海源叶生物科技有限公司；2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2．2+-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐( ABTS)、过硫酸钾：Sigma公司；亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、邻苯三酚、Tris-HCl等试剂，均为分析纯。

1.2试验方法

1.2.1人参茎叶提取液的制备

1.2.2总黄酮含量的测定

1.2.2.1标准曲线的绘制

 将120 0C芦丁标准品10 mg用70%乙醇溶解并定容到50 m L，配成浓度为0.20 mg/m L标准溶液，准确吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 m L分别置于10 m L试管中，各自用70%乙醇补充至2 m L，加0.3 m L 5%的NaNO2溶液，静置6 min，然后加入0.3 m L 10%Al(NO3)3溶液，静置6 min，最后加2 m L 4% Na OH溶液，静置10 min后于510 nm波长测定吸光度4。以芦丁质量为横坐标，吸光度A为纵坐标进行线性回归，得方程：y=0.003x+0.003 9，R2=0.999 9。

1.2.2.2黄酮含量的测定及计算

 准确吸取提取液0.2 m L，加入70%乙醇补至2mL．按如上标准曲线制备步骤测定吸光度，按标准曲线算出芦丁含量，再通过公式(1)进行总黄酮含量计算。

1.3抗氧化活性研究

1.3.1对DPPH．清除效果

 称取4 mg DPPH溶于无水乙醇并定容于100 m L容量瓶中，配成100μmol/L DPPH工作液；将人参茎叶盐酸水解转化前后的提取液及水解液依次稀释成5个不同浓度梯度，分别为原浓度的100%，80%，60%，40%和20%，编号为5，4，3，2和1（以下试验均相同），各取1 m L，分别加入100μmol/L DPPHI作液2mL，摇匀避光静置30 min;在517 nm下测定吸光度为A样品，以无水乙醇替代样品液测吸光度为A空白；根据公式(2)计算其清除率，清除率越大抗氧化能力越强。

1.3.2对羟自由基清除效果

  将人参茎叶盐酸水解转化前后的提取液及水解液依次稀释成5个不同浓度梯度，编号分别为5，4，3，2和1；在5个试管中分别加入9μmol/L的硫酸亚铁溶液2 m L，8.8 mo/L过氧化氢2 m L，9μmol/L水杨酸2mL，分别加入上述不同浓度的提取液及水解液2 m L，在37℃条件下反应30 min，冷却后于510 nm下测定吸光度为A样品，用2 m L的蒸馏水代替样液测得吸光度为A空白，根据公式(2)计算其清除率，清除率越大抗氧化能力越强。

1.3.3对超氧阴离子清除效果

 将人参茎叶盐酸水解转化前后的提取液及水解液依次稀释成5个不同浓度梯度，编号分别为5，4，3，2和1，各取1 m L加入到5个10 mL容量瓶中，分别加入pH 8.2，0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液4.5 m L，用蒸馏水补到6.0 mL，在25℃条件下预热20 min，再加入0.4mL 6.0 m mol／L邻苯三酚（含10 m mol/L HC1）溶液，均匀混合，25 0C下反应4 min后加2滴8.0 mol/L HCI终止反应，然后用蒸馏水稀释至刻度，在420 nm处测

1.3.4 ABTS法

  将人参茎叶盐酸水解转化前后提取液及水解液依次稀释成5个不同浓度梯度，编号分别为5，4，3，2和1；并将7 m mol/L的ABTS+．与2.45 m mol/L的过硫酸钾溶液等体积混合，避光放置16 h，配成ABTS储备液；使用前用无水乙醇将储备液稀释至其在734 nm波长下吸光度为2.00±0.10的ABTS+．工作液。取3 m LABTS+．工作液与0.3 m L不同浓度人参茎叶提取液及水解液，室温反应6 min后迅速与于波长734 nm处测得吸光度为A样品；同样取3 m L ABTS+．工作液与0.3mL 95%乙醇，室温反应后测得吸光度为A空白；取3 m L95%乙醇与0.3 m L样品液测得吸光度为爿对照，根据公式(3)计算其清除率。

1.3.5还原能力

 采用铁氰化钾法：将人参茎叶盐酸水解转化前后的提取液及水解液依次稀释成5个不同浓度梯度，编号分别为5，4，3，2和1；分别取2 m L的不同浓度的提取液及水解液于试管中，依次加入2 m L 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲溶液和2 m L 1%铁氰化钾K，Fe(CN)6溶液混匀，在50℃水浴中保持20 min后迅速冷却，再加入2 m L 10%的三氯乙酸溶液，振荡混匀后取2 m L的混合液和0.4 m L 0.1%的三氯化铁溶液，静置10 min，在波长700 nm处测得吸光度为A样品；用去离子水代替提取液测得吸光度为A空白；以质量浓度为0.25 mg/m L的VC代替提取液测得吸光度为AVC，根据公式(4)计算其相对还原力。

2结果与讨论

2.1  DPPH．清除能力

 DPPH．在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫红色，在517 nm波长处有强吸收。当有自由基清除剂存在时DPPH．的孤电子被配对，使吸收减弱或消失，颜色会变浅。吸收减弱的程度反映自由基清除剂的活性。由图1可以发现，盐酸水解转化前后人参茎叶提取液及水解液均随浓度的增加对DPPH自由基的清除率也增加，并呈现一定的量效关系；同时，转化后的水解液清除率均高于同浓度转化前提取液，转化前后最高浓度的清除率由75.08%提高至85.12%。说明人参茎叶提取液盐酸转化后的水解液具有更好的清除DPPH自由基作用。

2.2羟自由基清除能力

 羟自由基是体内最活泼的活性氧，可诱发链式反应导致自由基损伤，是氧自由基中危害最大的。水杨酸法是利用过氧化氢与Fe2+混合后产生．OH，而反应体系中加入的水杨酸能有效地捕捉．OH，并产生有色产物，该产物在510 nm处有强吸收；若加入的提取液具有清除．OH的作用，就会与水杨酸竞争．OH，使有色产物的生成量减少，从而通过测定其吸光度来进行判定。由图2可知，盐酸水解转化前后人参茎叶提取液及水解液均随浓度的增加对羟自由基的清除率也增加，转化后的水解液清除率较明显上升，并呈现一定的量效关系，但转化前的提取液清除率上升幅度不明显；同时，转化后的水解液清除率均高于同浓度转化前提取液，转化前后最高浓度的清除率由43.87%提高至77.90%。说明人参茎中提取液盐酸转化后的水解液具有更好的清除羟自由基的作用。

2.3超氧阴离子（O2-．）清除能力

 邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应生成O2-·和有色中间产物，该物质在420 nm处有强吸收，当反应体系中含有能清除O2-·的物质时它的生成得到抑制，邻苯三酚自氧化受阻，颜色变浅，420 nm处吸收峰减弱。由图3可以发现，盐酸水解转化前后人参茎叶提取液及水解液均随浓度的增加对超氧阴离子的清除率也增加，并呈现一定的量效关系；同时，转化后的水解液清除率将均高于同浓度转化前提取液，转化前后最高浓度的清除率由77.48%提高至90.09%。说明人参茎叶提取液盐酸转化后的水解液具有更好的清除超氧阴离子作用。

2.4  ABTS+清除能力

 ABTS+自由基是由过硫酸钾氧化ABTS产生的一种自由基，当体系中存在氢供体的抗氧化剂时，ABTS+自由基会因发生还原反应而褪色。由图4可以发现，盐酸水解转化前后人参茎叶提取液及水解液均随浓度的增加对ABTS的清除率也增加，并呈现一定的量效关系；但转化后的水解液清除率低于同浓度转化前提取液，转化前后最高浓度的清除率由83.40%下降至50.89%。说明人参茎叶提取液比经盐酸转化后的水解液具有更好的对ABTS的清除作用。

2.5还原能力

 当反应体系中有抗氧化剂时，会使铁离子一铁氰化钾复合物中的三价铁转变成二价铁，二价铁复合物在700 nm处有最大吸收，吸光度越大表明还原力越强。由图5可以发现，盐酸水解转化后的人参茎叶提取液随浓度的增加还原能力变化不大，而水解转化前提取液的还原能力随浓度的增加而增加，并呈现良好的线性关系；同时，盐酸水解转化前的提取液还原能力高于同浓度转化后的水解液；转化前后最高浓度的还原能力由55.41%下降至24.48%。说明人参茎叶提取液比经盐酸水解转化后的水解液具有更好的还原能力。

3结论与讨论

 1)经测定，盐酸水解前后提取液中总黄酮含量分别为0.51%及0.55%。前期研究发现，人参茎叶提取液中含有丰富的芦丁，经盐酸水解转化后的水解液中含有丰富的山柰酚，说明盐酸水解将芦丁几乎全部转化为黄酮苷元山柰酚。

  2)经盐酸水解后的人参茎叶水解液对DPPH自由基清除率由75.08%提高至85.12%，羟自由基清除率由43.87%提高至77.90%，超氧阴离子清除率由77.48%提高至90.09%；而ABTS清除率由83.40%下降至50.89%，还原能力55.41%下降至24.48%。由于试验中人参茎叶提取液对羟自由基清除率，盐酸水解转后的水解液相对还原能力等没有达到50%，因此，抗氧化性的比较没有以最高浓度的清除率来表达。

  3)江慎华等发现，荷叶提取液采用盐酸水解后所得酸解产物的抗氧化作用均显著提高，总还原力也提高。研究结果发现，经盐酸水解后的人参茎叶水解液比提取液对DPPH，羟自由基及超氧阴离子具有很好的清除作用，这与江慎华等的结果一致；但对ABTS的清除率及还原力，盐酸水解前的人参茎叶提取液具有更好的清除作用，与他们的结论不一致。初步推断人参茎叶黄酮苷元的抗氧化活性的强弱和黄酮的种类等其它因素也有一定的关系。

 4)人参茎叶资源丰富，其中总黄酮含量较高，提取工艺简单。因此，可进一步对人参茎叶总黄酮进行研究，有望其成为保健食品，化妆品等抗氧化剂的新原料。