王文1，黄继红1*，杨铭乾1,2，李海月1，纪小国，

 1．河南工业大学生物工程学院（郑州450001）；2．郑州市中食农产品加工研究院（郑州450001）

摘要为高效利用脱脂玉米胚芽蛋白，采用双酶分步酶解制备玉米胚芽蛋白水解液，通过单因素和响应面试验设计对酶解条件进行优化;利用膜分离对其进行初步纯化并测定其体外抗氧化活性。结果表明，一步酶解的最佳条件：碱性蛋白酶的加酶量为0.58%, pH 8.65，酶解4.78 h时，蛋白溶出率为57.70%+1.92%;二步酶解的最佳条件：木瓜蛋白酶加酶量0.11%，pH 6.54，酶解2.28后，蛋白溶出率达88.71%+1.5%；不同分子段蛋白质水解物均具有较强的自由基

清除能力和一定的还原力。纯化组分中<3 kDa肽段(E1)对超氧阴离子自曲基的清除效果最好，有望作为一种有效的抗氧化肽，在医药、食品和饲料行业等发挥应用优势。

关键词双酶分步酶解；蛋白溶出率；膜过滤：抗氧化活性

  玉米胚芽是玉米深加工产业最具附加值的副产品，脱脂后，其蛋白含量在20%左右，且其氨基酸组成较为均衡，人体必需氨基酸含量高于大豆和小麦中的含量，与FAO/WHO推荐的人类蛋白质标准具有很好的一致性。采用蛋白酶水解技术可有效将其功能基团释放出来。徐力等分离纯化玉米胚芽蛋白酶解物，得到结构为Leu-Asp-Tyr-Glu短肽，并验证此短肽具有抗氧化活性。玉米胚芽蛋白酶解物含有丰富的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等，可用于生产抗疲劳或运动后机体恢复的营养补给剂或作为改善肝病、肾病和肠道障碍等患者的补给剂；此外玉米胚芽肽还可制成功能食品，具有降血压、降胆固醇、抑制肿瘤细胞增殖的功能。

  目前，单酶酶解玉米胚芽蛋白的报道相对较多，陈彦平、丁继峰等采用木瓜蛋白酶对玉米胚芽蛋白进行酶解，水解度在14%左右。任建等利用2709碱性蛋白酶水解玉米胚芽蛋白，水解度可达22.46%，但其加酶量(5%)和调浆用水均较大。单酶酶解普遍存在原料利用率低、产品生理活性弱等问题。但由于酶本身也是蛋白质，同时加入两种不同的酶，可能引起两酶间的相互水解，或者不同蛋白酶之间产生竞争性抑制从而影响水解速度，且不同蛋白酶的最佳水解条件存在差异性。因此，试验采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解脱脂玉米胚芽，可有效提高蛋白溶出率；利用膜过滤对水解物进行初步的分离后，测定各组分对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力及总还原力，分析各水解组分的抗氧化活性，以期获得一种高抗氧化活性的玉米胚芽肽或酶解组分。

1  材料与方法

1.1试验材料试剂

 脱脂玉米胚芽粕（含蛋白18.2%）：湖北常香油脂股份有限公司提供；碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶均购于Solarbio公司；邻二氮菲，邻苯三酚，GSH等均为分析纯。

1.2主要仪器与设备

 雷磁pH计PHS-3E：上海精密科学仪器有限公司；UV-1000紫外分光光度计：天美（中国）科学仪器有限公司；半自动凯氏定氮仪：济南海能仪器股份有限公司；实验型膜分离设备（双工位平板膜）：赛普（无锡）膜科技发展有限公司。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程

1.3.2蛋白溶出率的测定

  按照凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）测定酶解液和原料中粗蛋白含量，蛋白溶出率的计算如式1所示。

1.3.3酶解液抗氧化活性测定

 包括羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和总还原力的测定。

1.3.4酶解条件的优化

1.3.4.1第一步酶解：碱性蛋白酶对玉米胚芽酶解效果的影响

 利用碱性蛋白酶对脱脂玉米胚芽粕进行酶解后，调pH 7.0，得混合物A，灭酶离心，测定玉米胚芽蛋白溶出率以评价酶解效果。分别考察碱性蛋白酶添加量（酶／底物重）(0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%)，酶解时间（1，2，3，4和5 h）和pH( 7.5，8.0, 8.5，9.0和9.5)对蛋白溶出率的影响。

1.3.4.2第一步酶解：响应面优化试验

 根据1.3.4.1单因素试验选择试验条件进行响应面试验，利用Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken试验设计，以加酶量（X1）、酶解时间（X2）和酶解pH（X3）为试验因素，蛋白溶出率为评价指标，采用三因素三水平的分析方法，对碱性蛋白酶的试验条件进行优化。试验因素与水平设计见表1。

1.3.4.3第二步酶解：木瓜蛋白酶对玉米胚芽蛋白酶解效果的影响

 将1.3.4.1所得混合物A加木瓜蛋白酶酶解后，调pH 7.0，灭酶离心，测定玉米胚芽蛋白溶出率。分别考察木瓜蛋白酶添加量(0.04%，0.08%，0.12%，0.16%和0.20%)，酶解时间(0.5，1.5，2.5，3.5和4.5 h)，pH（5.0，5.5，6.0, 6.5和7.0）对玉米胚芽蛋白溶出率的影响。

1.3.4.4第二步酶解：响应面优化试验

 根据1.3.4.3单因素试验结果，利用响应面法分析加酶量(A)、酶解时间(B)和酶解pH(c)的最佳值。试验因素与水平设计见表2。

2结果与分析

2.1第一步酶解：碱性蛋白酶对玉米胚芽蛋白溶出率的影响

2.1.1单因素试验

 由图1可知，蛋白溶出率随加酶量的不断增加而升高，当加酶量达0.6%以后，溶出率的变化趋于平缓。这是因为在底物浓度一定的情况下，提供给酶作用的肽键数是一定的，酶量饱和后，加酶量的增大对蛋白溶出率的影响不显著，最适加酶量在0.60%左右。

 由图2可知，酶解反应大致分为两个阶段，4h之前蛋白溶出率增加迅速，而4h之后，溶出率变化明显变缓。这可能是由于反应刚开始时，碱性蛋白酶浓度最高，活性最大，因此反应速度较快；随着反应的进行可参加反应的酶量减少，活性下降，反应速度放缓，表现为蛋白溶出率几乎不再增加。因此，碱性蛋白酶的酶解时间以4h左右为宜。

  由图3可知，玉米胚芽蛋白溶出率随pH的升高而增加，pH 8.5时，蛋白溶出率最大，其原因是随pH的增加，蛋白质与水之间的相互作用力增强，蛋白质溶解性提高，有利于酶解的进行；而当pH为8.5～9.5时，碱浓度过高导致酶解系统黏度增加，进而导致蛋白提取率下降。另外，pH过高容易使蛋白质分子脱氨、脱羧、肽键断裂，同时会发生“胱赖反应”，把氨基酸转化成有毒的化合物，影响酶解物的安全，因此，碱性蛋白酶的最适pH为8.5。

2.1.2响应面试验

  响应值二次模型的方差分析及显著性如表4所示。由表4可知，模型p<0.000 1，模型极显著，失拟项p=8 727>0.05不显著。因此，二次模型成立，可用此模型分析和预测碱性蛋白酶的酶解条件。分析其显著性，可知加酶量、酶解时间及pH对蛋白溶出率影响极显著；加酶量和酶解时间的交互作用显著影响蛋白溶出率。交互作用的响应曲面及等高线如图4所示。

 通过Design-Expert软件分析，由Design-Expert软件分析出碱性蛋白酶的最佳工艺参数为：加酶量0.58%、酶解4.78 h、pH 8.65，此时玉米胚芽蛋白理论溶出率为59.62%，在相应条件下进行3次验证试验，此条件下蛋白溶出率为57.70%，实际值与理论值相近，误差仅为1.92%，表明模型建立合理，预测的结果较为准确。

2.2第二步酶解：木瓜蛋白酶对玉米胚芽蛋白溶出率的影响

2.2.1单因素试验 

由图5可知，木瓜蛋白酶可显著增加玉米胚芽蛋白的最终溶出率，考虑酶解效果和酶解成本，选择0.12%作为最适加酶量。

 酶解时间对蛋白溶出率的影响如图6所示，在酶解时间为0.5～2.5 h时，蛋白溶出率呈直线增加，在2.5～4.5 h内，蛋白溶出率基本保持不变。且时间过长可能导致多肽的过度水解，因此选择2.5h为最佳酶解时间。

 不同pH对玉米胚芽蛋白溶出效果的影响趋势如图7所示，可知pH过大或过小均不利于蛋白的酶解，这可能与玉米胚芽结构改变有关。因此，木瓜蛋白酶的最适pH为6.5。

2.2.2第二步酶解：响应面优化试验

 利用Design-Expert 8.0.6软件对表5中的数据进行二次多元回归拟合，得到加酶量(A)、酶解时间(B)和pH对蛋白质溶出率(Y)的影响的预测方程

 由回归方差分析（表6）可知，模型p=0.000 1，极显著；方程失拟项p=0.190 6>0.05不显著，试验误差小，说明模型拟合可靠。方程一次项A、B、C极显著，二次项A2、C2极显著，B2显著，交互项AC、BC不显著，AB显著。因此，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，表明回归模型的意义和真实度良好，加酶量、酶解时间和酶解pH对蛋白质溶出率的影响极为显著；加酶量和酶解时间两因素间的交互作用显著。交互作用的响应曲面及等高线如图8所示。

 通过Design-Expert软件分析，预测出木瓜蛋白酶的最佳工艺参数为加酶量0.11%，酶解时间2.28 h，pH6.54，蛋白质溶出率的最大预测值为90.06%，在此条件下进行3次重复试验，蛋白质溶出率约88.71%，试验误差仅为1.5%，接近模型预测蛋白质溶出率。

2.3抗氧化试验结果

  研究表明，10 kDa以下肽类均对机体具有显著的免疫调节作用和抗氧化活性；Jumeri等以海鞘为原料制备的分子量在5.0±1.0 kDa，3.6±0.1  kDa的肽类具有较强的抗氧化和抗肿瘤活性。也有资料表明，分子量在2.5～3 kDa的肽类具有较为理想的抗氧化能力，但多肽的抗氧化活性主要与暴露的氨基酸侧链基团和肽序列有关。

2.3.1  自由基清除能力的测定

  玉米胚芽蛋白富含具有生物活性的氨基酸序列。由图9可知，各组分均具有较好的自由基清除能力。浓度均为1 mg/m L时，五种样品的羟自由基清除率均高于GSH，是GSH清除能力的1.22～1.54倍；而分子量小于3 kDa的玉米胚芽肽在5种样品中具有最强的DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力，分别为GSH清除能力的0.6倍和1.12倍。可知，小于3 kDa肽样的自由基清除能力与GSH基本相当，证明以脱脂玉米胚芽粕为原料制备抗氧化活性肽的方法是可行的。

2.3.2总还原力的测定

 总还原力常用来评价天然抗氧化剂给出电子或给出氢的能力。由图10可知，30～100 k Da样品的还原力最高，但仅达到GSH的41.78%，这可能与样品中有效抗氧化肽的含量有关。

3结论与展望

 通过双酶分步酶解玉米胚芽蛋白，单因素、响应面试验及实际试验验证，确定酶解玉米胚芽蛋白的最佳工艺条件为：碱性蛋白酶加入量0.58%，pH 8.65，酶解4.78 h后；再加0.110%的木瓜蛋白酶，pH 6.54，酶解2.28 h后，玉米胚芽蛋白溶出率高达88.71%±1.5%，溶出率与一步酶解相比提高31%左右。膜过滤和抗氧化试验结果表明，玉米胚芽蛋白酶解物和各纯化组分均具有较好的抗氧化活性；其中小于3 kD a肽段(E1)对超氧阴离子自由基的清除效果最好，作为天然的抗氧化物，E1具有低毒高效的优势，有望在医药、食品和饲料行业等发挥应用优势。

 虽然试验较为系统的制备了玉米胚芽蛋白酶解物，并对不同分子量段酶解物进行了抗氧化活性测定，但抗氧化肽（<3 k D a肽段）分子量的准确确定及抗氧化机理等还需进一步研究。