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茁芽短梗霉P1012产普鲁兰多糖的条件优化

 袁林1,郭建军1,王贤卓1 ,2,曾静1,杜建华3

  1.江西省科学院微生物研究所(南昌330096);2.南昌大学中德联合研究院(南昌330029);3.南昌工学院(南昌330108)

摘要研究了培养基组分(蔗糖、米糠和L-抗坏血酸)及发酵条件(pH、温度、接种量和转速)对茁芽短梗霉P1012 (Aureobasidium pullulans P1012)产普鲁兰多糖的影响,以期提高普鲁兰多糖的产量。研究对培养基组分进行单因素试验及优化发酵条件,再结合正交试验考察了三因素(米糠、蔗糖和L-抗坏血酸)两水平对普鲁兰多糖产量的影响,从而优化茁芽短梗霉P1012发酵工艺,并通过上5L发酵罐发酵培养验证。试验确定最佳培养基配方为蔗糖70 g/L、米糠3g/L和L-抗坏血酸3 g/L。发酵条件控制为温度28℃、pH 5.0、接种量4%以及转速200 r/min。经5L发酵罐培养后,测定普鲁兰多糖产量达到43.77 g/L,糖转化率为62.53%。发酵液pH由5.00升至6.56,黏度达到52.10mPa.s,具有特别的芳香气味。获得茁芽短梗霉P1012的发酵工艺参数,为进入工业化生产提供依据。

关键词  茁芽短梗霉;普鲁兰;正交试验:发酵工艺

 茁芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)属于半知菌类短梗霉属,是一种具有多细胞形态的腐生真菌,可合成两种胞外多糖:普鲁兰多糖和β-葡聚糖(不溶于水的果冻状物质)。其中,普鲁兰多糖又称为短梗霉多糖,是一类以a(1→6)糖苷键链接的麦芽三糖重复单位,具有溶解性、阻氧性和可降解性等特性,现被广泛运用于食品加工、医药和环境保护等行

业中。尽管普鲁兰多糖具有很多特性及巨大的应用前景,但市场上商业化成品还较少。究其原因在于价格过高,达到160元/kg,是其他的多糖(如黄原胶)价格的三倍。因此探究使用价廉原料作为碳源、氮源等其他培养基组分,可降低普鲁兰多糖的生产成本,促进普鲁兰行业的发展。Wang等利用谷壳水解物作为碳源用于茁芽短梗霉的发酵生产,较少原料成本。Sharma等研究了利用米糠油饼、大豆油饼、棉花籽油饼、芥末籽油油饼和玉米浆为氮源发酵生产,结果发现玉米浆最利于提高普鲁多糖产量,达到77.92 g/L。Seo等研究发现黄豆渣作为碳源,比酵母的效果更好,普鲁兰产量达到5.5 g/L。Goksungur等运用响应面发优化马铃薯水解物培养基,测得Aureobasidiumpullulans P56普鲁兰多糖产量为19.2 g/L。试验前期通过复合诱变过程,选育出一株茁芽短梗霉P1012,但未研究优化其培养基组分及发酵条件。研究采用蔗糖为碳源,米糠作为氮源及其他微量元素的来源,并使用L-抗坏血酸作为特殊添加物,促进普鲁兰多糖的合成。试验采用单因素试验、正交试验,最终获得茁芽短梗霉P1012产普鲁兰多糖的发酵工艺,并通过发酵罐验证,从而提高普鲁兰多糖的产量,降低生产成本。

1材料与方法

1.1菌种与培养基

 茁芽短梗霉P1012(Aureobasidium pullulansP1012)由实验室分离的菌株P23作为原始菌株,经紫外线、亚硝基胍和硫酸二乙酯复合诱变处理筛选获得。

 PDA斜面培养基(g/L):马铃薯200,琼脂粉20,葡萄糖20。

 种子培养基( g/L):蔗糖20,酵母粉5,自然pH。

 发酵培养基( g/L):蔗糖50,米糠3,L-抗坏血酸2。

1.2方法

1.2.1菌种活化及菌液制备

 从斜面(茁芽短梗霉P1012)上挑取一环种子接种于试管中,28℃,180 r/min摇床培养48 h。按2%的接种量,将活化的菌种液接种于种子培养基中,28℃,180 r/min摇床培养48 h。

1.2.2单因素试验

 研究不同浓度的蔗糖(0,50,60,70,80和90 g/L),米糠(0,3,4,5和6 g/L)和L-抗坏血酸(0,1,2,3和4 g/L)对普鲁兰多糖产量的影响,获得培养基组分的最佳浓度水平,为正交试验设计提供依据。

1.2.3正交试验

  对培养基组分(蔗糖、米糠和L-抗坏血酸)进行三因素两水平正交试验设计。用正交试验设计助手3.1软件对试验数据进行分析,以糖转化率(%)作为衡量指标。

1.2.4发酵条件优化试验

 考察温度(20℃,22℃,24℃,26℃,28℃和30℃),pH(4.0,4.5,5.0,5.5,6.0和6.5),接种量(2%,4%,6%,8%和10%),转速(100,150,200和250 r/min)对普鲁兰多糖发酵生产的影响。

1.2.5发酵罐验证发酵工艺

  基于最优的发酵工艺,将活化的种子液接种于SL发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司),装液量为3.5 L,通气量2L/min。发酵周期为4d,每隔12 h取一次样,冻存于-80℃超低温冰箱中。发酵结束后,取出所有样品,测定生物量,普鲁兰产量等参数,并绘制发酵曲线。

1.2.6分析方法

  1)生物量:发酵液于12 000 r/min下,离心5 min.并收集菌体。将菌体于105℃烘箱过夜,电子天平称重。

 2)普鲁兰产量:取发酵液离心后的上清液,加入两倍体积的无水乙醇,静止4h。15 000 r/min下,离心8 min,收集多糖沉淀。将多糖沉淀于真空冷冻干燥机内过夜干燥,电子天平称其质量。

 多糖的转化率=普鲁兰产量( g/L),培养基中蔗糖含量( g/L)×100% (1)

 3) pH:发酵罐在线测定(Mettler pH电极)

 4)溶氧( DO)值:发酵罐在线测定(Mettler DO电极)。

 5)发酵曲线绘制:统计各个发酵参数,并使用软件Sigma plot 12.0绘制发酵曲线。

 6)发酵液的黏度:使用ND-J5S旋转黏度计(上海昌吉地质仪器有限公司)测定。

2结果与讨论

2.1培养基组分的单因素试验

 由表1—3可知,增加蔗糖浓度,可提高普鲁兰多糖的产量,但糖转化率也随之降低。米糠作为氮源及微量元素的来源,对普鲁兰的产量影响较大,最适浓度为4 g/L。L-抗坏血酸作为抗氧化剂,抑制菌体褐化反应,提高普鲁兰的产量。研究表明,除了L-抗坏血酸外,大豆油、尿嘧啶和吐温_80等物质,也可以提高普鲁兰的产量。因此普鲁兰多糖产量最高的培养基组成浓度为蔗糖70 g/L、米糠4 g/L以及抗坏血酸2 g/L,可作为正交试验的浓度水平依据。

2.2影响产普鲁兰多糖的发酵条件优化

 由表4~7可知,温度、pH、接种量和转速对普鲁兰的产量都有明显影响。最适的温度为28℃,pH5.0。有研究表明高温,低pH有利于普鲁兰多糖的合成。接种量过低或过低都不利于普鲁兰多糖的合成,原因在于接种量低时,更多养分用于菌体的生长,发酵周期延长,而接种量过大,则会影响溶氧。转速的大小影响溶氧,尽管茁芽短梗霉属于好氧真菌,但过高的溶氧会对细胞质膜形成伤害。因此采用接种量4%,转速200 r/min。

 由表8的极差值R和表9方差分析可见,影响普鲁兰多糖产量的培养基组分的顺序为蔗糖>L-抗坏血酸(g/L)>米糠,且所有的培养基组分对普鲁兰多糖产量的影响具有显著意义(p<0.05)。由试验结果分析可得茁芽短梗霉P1012培养基的最佳组合为蔗糖70g/L;米糠3g/L; L-抗坏血酸3 g/L。

2.3发酵罐验证发酵工艺

 在摇瓶优化发酵条件的基础上,进行了5L发酵罐的扩大培养。装液量为3.5 L,加消泡剂0.5%,用Na OH溶液调pH到5.0,115℃灭菌30 min,培养温度28 0C,搅拌转速200 r/min,通气量2 L/min。发酵4d结束,此试验重复3次。试验结果如图1。

 从图1可以看出,pH在0~24 h时间段内,变化较小,但24~72 h内,pH不断升高,最高达到6.75左右,随后就开始降低,而使用通用培养基时,pH变化是不断下降的过程;溶氧量( DO)从100%降到28.3%,说明茁芽短梗霉是好氧的微生物;发酵72 h后,开始产生特殊的芳香气味;发酵96 h后,黏度达到52.10mPa.s,普鲁兰多糖产量达到43.77 g/L,糖转化率为62.53%。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵,因此,普鲁兰多糖产量和糖转化率都明显好于摇瓶发酵。

3结论

  通过单因素试验及正交试验,最终确定茁芽短梗霉P1012最佳发酵工艺参数:蔗糖70 g/L,米糠3g/L,L-抗坏血酸3 g/L,温度28℃,接种量4%,pH 5.0,转速200 r/min。基于最佳发酵工艺,测得出茁芽短梗霉P1012的普鲁兰多糖产量达到43.77 g/L,糖转化率为62.53%,黏度为52.10 mPa.s,具有特殊的芳香气味。试验采用的培养基(米糠、蔗糖和L-抗坏血酸)组分简单,价格低廉,可为降低普鲁兰多糖的生产成本提供了参考。

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