李克亚1，文章1，邓斌2．李周1，胡承1*

  1．四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室（成都610064）：

 2．重庆市食品药品检验检测研究院（重庆401121）

摘要窖池环境和其中多样的微生物构成了浓香型大曲酒发酵的特殊生态系统，其中蕴藏着丰富的微生物资源。试验通过对两个酒厂的新老窖池的不同取样位置的窖泥样品进行基于Illumina Miseq平台对细菌V3可变区进行高通量测序并结合理化性质的测定，研究各窖泥样品原核生物的群落结构，以及窖泥理化性质和窖泥中所含放线茵丰度的联系。研究结果初步表明，窖池老熟过程本质上是窖泥理化性质与其中微生物群落多样性交互作用的过程。

关键词  窖泥；多样性分析；丰度；高通量测序；原核生物

 酿造浓香型大曲酒需要经过窖池发酵这一过程，窖泥是各种微生物进行发酵、代谢的场所，浓香型大曲酒生产采用全泥窖发酵，酒质直接与窖泥质量相关。在窖内微生物作用下，人窖糟醅发酵正常会使其香气就更浓郁，酒体也会丰厚饱满，形成浓香型大曲酒“窖香浓郁，绵甜醇厚”的独特风格。新窖池微生物类群繁杂不稳定富集有限，新泥味重，新窖池产酒很多香味不协调，口感较差；老窖池的窖泥微生物丰富，酶系复杂，驯化成熟，年份越久的老熟窖池越容易产出酒质稳定、品质优良的原酒。

 随着现代分子生物技术的蓬勃发展，为群落多样性、物种丰度提供了越来越丰富的研究方法。高通量测序作为“下一代”测序技术近年来迅速发展起来，它具有测序准确率高、耗时短以及信息处理量大等优点，结合生物信息学的数值分析，能科学地表征或预测微生物的群落结构。试验结合考察了不同窖龄窖池理化性质趋势性改变和其中原核生物类群与含量，讨论了窖池老熟过程与窖池放线菌丰度变化可能存在潜在关系。研究通过Miseq平台高通量测序分析了两个厂的新老窖泥原核生物的含量和丰度，探究放线菌的含量与窖池各项理化指标的关系，提出了放线菌丰度作为窖池性能指标的可行性。

1  材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

 供试样品：成都蜀之源酒业（以下简称A酒厂）窖龄为5年、20年的封窖泥、窖壁泥和窖底泥；四川丰谷酒业（以下简称B酒厂）窖龄为5年、30年的封窖泥、窖壁泥和窖底泥。每个样品取样采用五点混合并混匀的方式，取样后样品于-20℃冰箱保存备用。11个样品及样品编号见表1。

 土壤细菌总DNA提取试剂盒：北京，天根；TaqMaster Mix: Vazyme，南京；San Prep柱式DNA胶回收试剂盒：Sangon，上海；DNA marker 2000: BioTeke，北京；其他生化试剂为分析纯。

 离心机：TGL-16B．上海安亭科学仪器厂；电泳仪：BG-Power 600，北京白晶生物技术有限公司；PCR仪：MG-96G，杭州明基科学仪器有限公司；紫外凝胶成像系统：BIO-RAD，USA。

1.2理化指标测定与方法

  含水率：分别取一定量的样品称量，电热烘箱内105℃将样品烘干至绝干，再次称量计算含水率。

 吸水性：分别取适量各窖泥样品，105℃烘干样品后，碾磨样品至泥土组分成粉末或小颗粒状，20目过筛除去泥样中的酒糟。再于105℃烘箱中烘干恒重。每个样品各称取Sg于培养皿中，置于恒温恒湿培养箱，条件为40℃、湿度95%、12 h。每隔th重新称量，直至质量不再增加。

 pH：规定土壤pH为土壤与水1:1悬浮液pH，通过酸度计直接读取pH。

 腐殖质含量：采用冷凝回流提取腐殖质，提取的腐殖质用重铬酸钾容量法测定。

1.3  土壤细菌总DNA提取

 将窖泥解冻后分别取等量(0.3 g)样品使用土壤基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，每个样品提取3个重复用于保证试验结果的可靠性。用1.5%的琼脂糖胶电泳和V3区预扩增检测DNA的大小与片段完整性，总DNA于-20℃冷冻保存备用。

1.4样品16S rDNA V3可变区的扩增和高通量测序

选用细菌16S rDNA通用引物，F端加barcode序

1.5群落组成分析

 基于Miseq平台的测序得到的每个窖泥样品文库的OTU丰度信息，从而可以获得各分类水平下各类群的丰度含量。其中考察每个样品中放线菌群在测序样本中的占比，探索窖泥放线菌丰度与取样位置和窖龄长短的相关性。

1.6窖泥原核生物多样性分析

 根据对物种多样性研究的尺度范围不同，物种多样性可分为a多样性、β多样性和y多样性。a多样性主要关注局域均匀生境下的物种数目，即生境内的多样性；β多样性指沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的相异性或物种沿环境梯度的更替速率，也被称为生境间的多样性；y多样性描述区域或大陆尺度的多样性，是指区域或大陆尺度的物种数量，也被称为区域多样性。评估群落a多样性采用对测序序列进行随机抽样的方法，借助抽选测序的序列数与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线。有多种指数可评估物种的a多样性，如Shannon-Wiener指数、Gleason指数、Margalef指数、Pielou均匀度指数、种间相遇机率( PIE)指数和Simpson多样性指数等。其中，Shannon-Wiener指数利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此  反映各样品群落的异质性，Shannon-Wiener指数计  算在不同测序数量时的微生物多样性，测序量越大  Shannon-Wiener指数反应的多样性越准确。Simpson  多样性指数表征在无限大小的群落中随机取样得到同样的两个样本属不同种的概率，值越大说明群落多样性越大。

1.7主成分分析

 主成分分析( Princ,ipal component analysis，PCA)，通过线性变换从多个变量中选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法。为了进一步提炼Miseq平台测序数据提供的有价值信息，对各窖泥样品原核生物OTU组成进行分析并相似聚类，可以反应出各窖泥样品间的差异和距离。

2结果与讨论

2.1各窖泥样品理化性质

 细胞中的各种生理生化反应都必须有水的参与才能进行，窖泥中的水分保障了其中微生物能正常进行必要的生理代谢调节。窖泥中水分的含量高低在一定程度上影响着窖泥质量的好坏。水分过低，窖泥板结会影响微生物的生长繁殖；水分过高又影响窖泥中一些微生物代谢，还会引起窖泥的黏着力下降。无论水分过高或过低都会影响窖泥质量从而影响出酒质量。因此适度的水分含量是窖泥老熟的重要因素。如图1(A)所示，两厂老窖池的含水量均低于新窖池；图1(B)中，随着窖龄增加，窖泥（尤其是窖底泥）的吸水率表现出明显下降，窖泥吸水率降低使得酒醅由经窖泥渗透失水降低，同时减少了酒精和香味物质等随着水分一起流失。pH会影响微生物代谢过程中一些酶的活性，过高或过低的pH都会限制微生物生长代谢。优质窖泥的pH-般在5～7范围内，由图1(C)可见，除封窖泥pH略高，为中性或弱碱性，A、B两厂新窖池pH较低，老窖池pH高于新窖池，达到了一般优质窖池的弱酸性pH范围。图1(D)~(E)分别给出了A、B两酒厂各新老窖泥样品中腐殖质的含量，老窖泥的中层和底层窖泥的腐殖酸含量都低于新窖泥。

2.2  窖泥总DNA的提取

 使用土壤细菌总DNA提取试剂盒共提取11个泥样的总DNA，共33份，电泳结果以及DNA的浓度检测显示平行样品的结果较一致。测序共获得47483条原始序列。测序量最低的为B酒厂30年窖池封窖泥，最高的为B酒厂30年窖池中层窖壁泥。99%以上序列的净长度在300～420 b p之间，细菌16S rRNA基因V3区的平均长度为180 b p，试验的测序长度能覆盖V3区全长。

2.3群落组成分析

 采用RDP classifier对序列进行分类地位的鉴定，发现窖泥样品中的序列主要来自于变形菌门( Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门( Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、放线菌门( Actinobacteria)、WWE1、疣微菌门( Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、柔壁菌门( Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和泉古菌门( Crenarchaeota)等（见图2）。其中，变形菌门和厚壁菌门在各样本中含量占绝对优势，与变形菌门和厚壁菌门多是营兼性或者专性厌氧及异养生活相对应。其中，厚壁菌门在新老窖池的中层窖泥和窖底泥中的含量有明显差异，均是老窖池中相对含量更高。

 图3为各窖泥样品中测序检出序列中放线菌所占丰度，A酒厂新老封窖泥放线菌丰度明显高于其他样品，与放线菌是好气菌有关。放线菌更适于生长在中性或微碱性环境中，结合图1(C)和图3可以看出，放线菌丰度除了与窖池位置相关外，与各其所在环境pH具有明显相关性。从新老窖池水平看放线菌丰度规律不明显，A酒厂中层新窖窖池窖泥中放线菌含量高于老窖池，而在新窖池窖泥在底层的放线菌含量又低于老窖池；B酒厂中层新窖窖池窖泥中放线菌含量低于老窖池，而在新窖池窖泥在底层的放线菌含量则很接近。放线菌是产生土腥素的主要来源，从生产经验上看来，老窖的土腥味往往低于新窖，故推断新窖的放线菌丰度应该更高。试验测得放线菌总丰度与窖龄长短联系并不显著，原因可能是不是所有放线菌都会释放土腥素，还可能是老窖中多样的微生物资源对腐殖质起到分解作用，而并非放线菌丰度降低直接导致。因此放线菌与窖龄长短的关系还有待进一步研究。

2.4窖泥样品a多样性的评价

 97 010的序列相似度可归为一个种，因此将该相似度的序列归为一个OTU，检出各样品中OTU数量。如图4 (A)所示，随着检测样本量的增加，曲线斜率减小趋于平缓，说明此时的测序数据量较为合理；且样品间OTU有较明显的差异，能体现各窖泥样品中微生物多样性的差异。测序中，最大抽样测序片段样本量为16 429，此时检测到OTU最多和最少的样品分别是B酒厂30年窖龄的中层窖壁泥(1 532)和B酒厂30年窖龄的封窖泥( 891)，由于封窖泥处于窖池表层，每轮生产封窖增加了与外界接触的机会，引起封窖泥中微生物的含量和种类具有较高的随机性。除封窖泥外，OTU最低的是A酒厂20年窖龄窖池的底层窖泥，接下来是B酒厂30年窖龄窖池的底层窖泥，故老窖池的底层窖泥趋于含有较少的类群数目。其余样品检出OTU数较为接近，OTU介于1 300~1  404之间。

 根据97%水平下OTU的丰度信息，使用Shannon-Wiener指数和Simpson指数对各窖泥原核生物多样性进行评估。图4(B)每条曲线代表一个样品，初期测序量远不覆盖样品，曲线直线上升，当测序量超过1 650以后，曲线逐渐趋于平滑，说明测序条数足以覆盖试验样品中的大部分窖泥原核生物。从图4(B)可看出新窖池底层窖泥Shannon-Wiener指数最高，其群落多样性最大；老窖池底层窖泥Shannon-Wiener指数最低，其群落多样性最小。中层窖壁泥的Shannon-Wiener指数同样是新窖池比老窖池高，新窖池体现出更高的群落多样性。以上数据结果表明：窖池窖龄越接近，其细菌群落多样性程度也更相近，试验检测的样品中老窖池的细菌群落多样性低于新窖池，体现出窖池微生物群落驯化的过程。图4(C)中，Simpson指数曲线也能得到和Shannon-Wiener指数曲线相似的结果。

2.5主成分和聚类分析

 主成分分析图是基于每个样品中所含有的全部OTU完成的，以百分数的形式体现主成分主要影响程度。如图5 (A)所示，每个点代表了一个样品，主成分1( PC1)和主成分3(PC3)是造成窖泥样品差异的两个最大特征，贡献率分别为46.63%和12.09%，两点之间在横、纵坐标上的距离，代表了样品受主成分（PC1或PC3）影响下的相似性距离；图5(B)为聚类分析结果，用距离长短直观反映了各样品的相似性和差异性。

3结论

 窖池的老熟过程是窖池环境与窖泥微生物不断相互作用的过程，窖池熟化过程也富集了窖泥中一些微生物，这些菌群在窖池中生长代谢也影响了窖泥的性能。窖泥在老熟过程中，水分含量会发生改变，供试样品中老窖泥的含水量和持水率都有所降低，中、底层窖泥pH升高呈弱酸性，腐殖酸含量降低。初步推测可能的原因是新窖泥初始配方中添加的腐殖酸较丰富。不同窖龄窖池不同位置窖泥的原核生物丰度有所差异，这是生产工艺以及酿造环境共同作用的选择结果，同时窖池中各菌群生长代谢也为窖池老熟提供了推动力。

 试验通过Miseq平台高通量测序技术，基于V3可变区的测序结果，揭示了两酒厂不同取样位置不同窖龄窖泥的细菌群落多样性。对测序序列进行分类地位的鉴定发现．窖泥样品中的序列主要来自于变形菌门( Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门( Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、放线菌门( Actinobacteria)、WWE1、疣微菌门( Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)、柔壁菌门( Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和泉古菌门( Crenarchaeota)等，其中占绝大多数的是厌氧菌。多样性分析和聚类分析给出了样本间的相似性和差异性。试验为窖泥微生物资源的研究和窖池的老熟程度评估做了一定探索。