叶茂，邓毛程

1．广东轻工职业技术学院食品与生物工程系（广州510300）；2．广东高校特色调味品工程技术开发中心（广州510300）

摘要试验以农产品加工废弃物为主要原料，采用响应面法对1株高产氨肽酶的米曲霉Y-15固态发酵产酶条件进行优化。应用Plackett- Burman试验筛选出三个重要影响因子：麦麸、豆粕和水，中心组合响应面试验对重要影响因子进一步优化，最终确定产酶培养条件为麦麸179.8g豆粕为191.6 g，水的添加量为386 g，在此条件下，氨肽酶的酶活力达到2 879.67 U/g。该米曲霉的培养基成分为农业加工废弃物，极大降低生产成本，具有一定的生产研究价值。

  关键词  米曲霉；氨肽酶；固态发酵；优化；响应面分析

  氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个游离出来的水解酶，其底物作用范围一般较为广谱，不仅能够水解多肽，而且能水解完整的蛋白质分子。氨肽酶主要应用于食品工业中：当蛋白质大分子酶解时，肽链中含有的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾而呈现苦味，而这些疏水性氨基酸一般位于肽链末端，而利用氨肽酶进一步水解蛋白质水解液，可以脱除其苦味；与蛋白酶复合使用，在酱油酿造、鱼露生产及其它蛋白水解产品的制备过程中，不仅可以提高蛋白质的利用率，而且能形成风味独特、滋味鲜美的复合氨基酸水解液。

 氨肽酶不仅存在于高等动物的胰脏、肠液中，也广泛分布于多种植物、真菌、细菌和原生动物体内，其中对于真菌氨肽酶的结构、功能、调控机制和生产应用等方面已经进行了较为广泛和深入的研究。目前，国外已有通过曲霉发酵生产氨肽酶，实现了氨肽酶酶制剂商品供应，国内氨肽酶发酵生产及应用方面的研究仍处于起步的阶段。米曲霉（Aspergillus oryzae）作为氨肽酶的重要生产菌之一，其发酵工艺条件已经得到了研究，但主要采用的是液态发酵

法。而固态发酵法具有培养基简单且来源广泛、能耗低、环境污染较少的优点，并且固态发酵更有利于曲霉的生长繁殖和产酶。因此如何实现氨肽酶的规模化生产、降低成本来满足商业化的需要，对于提高我国的相关产业发展水平具有重要意义。试验是在前期试验筛得到的高产氨肽酶米曲霉Y-15的基础上，利用农业加工的副产品进行固态发酵法，初步研究其产酶发酵工艺条件，以提高该菌株氨肽酶产酶水平，降低生产成本，为进一步研究利用提供参考。

1  材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

 米曲霉（A．oryzae）Y-15：实验室从酱油曲种中筛选获得，斜面保藏于4 0C冰箱。

1.1.2材料与试剂

 碳源（麸皮、甘蔗渣、米糠、木屑）和氮源（豆粕、花生粕、菜籽油饼、玉米粉）：市售；氨肽酶底物（L-亮氨酸-p -对硝基苯胺）：美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器与设备

 SW-CJ-ZFD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；722N型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1  出发菌株的活化

  将米曲霉菌株接种于马铃薯( PDA)培养基进行活化，30℃培养3～4 d，待长满黄绿色孢子后备用。

1.2.2单孢子悬液的制备

  取培养好的斜面，用无菌生理盐水洗脱孢子后转移至装有玻璃珠的无菌锥形瓶中，充分摇动使孢子散开，用带脱脂棉的无菌漏斗过滤除去菌丝得到孢子悬液，将孢子浓度调整到5×106个/m L备用。

1.2.3  固态发酵培养

  称重500～1 000 g的固态发酵培养基置于金属托盘( 120 cm×100 cm×10 cm)，培养基的配方根据单因素试验和响应面分析试验设计，通过添加盐酸和氢氧化钠水溶液来调节培养基的初始pH和水分，然后121℃高压蒸汽灭菌20 min，待培养基冷却到室温，将1 m L的5 x 106个/m L的孢子悬液接种到固态发酵培养基中，在30℃下，保持相对湿度在85%，恒温培养3d。所有的试验都是平行3次。

1.2.4粗酶液的提取

  分别称取10 g成曲，研磨后加入100 m L蒸馏水，40℃浸提1h，其间搅拌2～3次。根据不同酶活力测定所需的缓冲液分别定容到合适的稀释度，用中速定性滤纸过滤，滤液即为粗酶液。同时测定曲料水分，酶活力用曲料干基重量表示，即U/g。

1.2.5氨肽酶活力的测定方法

  采用L-亮氨酸-p-对硝基苯胺为底物测定。

1.3数据处理

  所有数据用Design-Expert 8.07软件进行分析。

2结果与分析

2.1单因素试验

  采用单次单因素法，假设各因素间不存在交互作用，1次改变培养基的1个因素的水平而其他因素保持不变，然后逐个进行考察优化，作为Plackett -Burman试验的准备。

  结果表明，当碳源为麦麸时，氨肽酶的固态发酵酶活力最高(1960±120 U/g)，其它依次为米糠(1230±150 U/g)、甘蔗渣（1026土118 U/g）和木屑( 913±80 U/g)；当氮源为豆粕时，氨肽酶的酶活力最高（2 012±43 U/g），其它依次为玉米粉（1796±108 U/g）、花生粕（1 320±160 U/g）和菜籽油饼（1100土78 U/g）；无机盐中的Na Cl和K2PO3对氨肽酶的固态发酵酶活力有正相关性，其它的MgSO4、MnSO4、H2O、FeCI3．H2O和CaCl2则没有影响；接种量为2%时，氨肽酶的固态发酵酶活力达到最高(2 004 ±116 U/g)；初始pH为7.0时，氨肽酶的固态发酵酶活力最高（2 060±88 U/g）；水分含量为50%时，氨肽酶的固态发酵酶活力最高(2 160±90U/g)。

2.2 Plackett-Burman设计试验确定显著因素

 在上述单因素试验结果优化的基础上，利用Plackett-Burman设计试验分析米糠（X1）、麸皮（X2）、Na CI（X3）、K2PO3（X4）、玉米粉（X5）、豆粕（X6）、pH（X7）、接种量（X8）和水分（X9）等9个因素的显著性，每个因素取2个水平(见表1)。并运用软件进行试验设计，每个试验重复3次，对应的响应值取平均值，试验设计及结果见表2。

 对Plackett-Burman试验数据进行分析，结果如表3所示。影响米曲霉Y-15固态发酵产氨肽酶的显著因素分别是麸皮（X2; p=0.014）、豆粕(X6)；p=0.021)和水分（X9；p=0.032）．均小于0.050，可以作为进一步优化的因素，其他因素对结果影响不大，在进一步研究中，取中间水平，对影响效果不进行分析。此外，回归方程的系数R2=0.988 4，调整后R2Adj =0.936 1，表明多项式模型拟合较好。

2.3最陡爬坡试验

 根据Plackett-Burman试验结果，显著因素豆粕（X6）对酶活力表现为正效应，显著麸皮（X2）和水分（X9）对酶活力表现为负效应，根据这3个显著影响因素效应的大小确定试验的爬坡方向和变化步长，以最快的速度逼近最大响应值（酶活力）的区域，试验设计与结果见表4。

 由表4可知，显著因素浓度在试验6的条件下，酶活力最高(2 630±122 U/g)，因此选择试验6的条件作为响应面设计因素水平的中心点，即麸皮（X2）、豆粕（X6）和水分（X9）分别为180，190和360 g。

2.4响应面法优化

  根据中心组合试验设计原理，设计三因素三水平共20个试验点的响应面分析试验，其中14个析因点，6个零点重复，用以估计试验误差，以氨肽酶酶活力为响应值，分析米曲霉Y-15固态发酵氨肽酶活力的最佳条件。响应面设计的因素与水平取值见表5，试验设计与结果见表6。

 以氨肽酶固态发酵的酶活力为响应值，运用Design-Expert软件进行回归拟合，得到回归方程：

  对此模型进行方差分析，结果见表7。从表7可以看出，在a=0.01水平时，模型回归极显著( p=0.000 1)，该模型R2=0.989 2，R2Adj=0.978 5，失拟项不显著( p=0.064 1)，可见该方程对试验数据进行了很好的拟合。根据模型方程做响应面（图1），通过该组动态图可评价诸因素之间对成曲中蛋白酶活力的交互作用，同时可确定各因素的最佳水平及组合，得到X1=-0.04、X2=0.16、X3=0.3，即麦麸为179.8g，豆粕为191.6 g，水为386 g。

按照得到的优化结果将米曲霉接入固态发酵培养基，制曲培养3d，测定成曲中氨肽酶活力，3次平行试验分别为：2 863，2 901和2 872 U/g，平均酶活力为2 879.67 U/g，预测值Y=2 888.08接近，试验与预测值有较好的拟合性。

3结论

  试验考察了碳源、氮源、初始pH、多种金属离子及水分对米曲霉（A．oryzae）Y-15固态发酵产氨肽酶的影响。在单因素及Plackett-Burman试验的基础上，采用中心组合响应面法对发酵条件进行优化，并建立了酶活力与麦麸、豆粕及水的添加量之间的二次多项回归模型，得出最优发酵条件为麦麸179.8 g，豆粕为191.6 g，水的添加量为386 g，在此条件下，氨肽酶的酶活力达到2 879.6 7 U/g。并且主要培养基成分为麦麸和豆粕，均来源于农业加工废弃物，成本低廉，而氨肽酶的酶活力较高，为氨肽酶工业化生产的研究提供试验基础。