周小理，王雨蔷，唐文，谢凡，周一鸣*

 上海应用技术学院香料香精技术与工程学院（上海201418）

摘要试验以传统名食烤鸭为原料，重点对其水溶性提取物的细胞抗氧化活性进行了研究。试验通过水溶提取、凝胶层析(葡聚糖凝胶G15)分离烤鸭中的活性物质，并对其对细胞(胃癌细胞，MGC-803)增殖和细胞内抗氧化酶活性的影响进行了研究，并同时选取最优组分进行细胞氧化损伤模型的建立。试验结果表明：烤鸭粗提取物和经凝胶层析纯化得到的4种组分（D1，D2，D3和D4）对细胞增殖能力及抗氧化酶活性等指标有较好的提升作用，其中组分D3最大程度地促进了细胞增殖，提高了细胞中抗氧化酶(SOD)的活性，并且对过氧化氢诱导损伤细胞具有明显的保护作用。

关键词  烤鸭：水溶提取物；凝胶层析；细胞抗氧化

 烤鸭作为中华民族的传统名食，主要分为北京烤鸭和广式烤鸭，其中北京烤鸭最负盛名，是中华民族饮食文化的瑰宝。烤鸭具有营养全面、蛋白含量丰富，含有多种营养素等特点。现今市面所售烤鸭多采用挂炉烤制工艺，烤制前需经涂糖处理，烤制温度和时间控制在230℃～250℃、30～50 min，这为美拉德反应的发生提供了基础条件。美拉德反应作为食品

加工中普遍存在的非酶褐变反应，是食品中羰基化合物（糖类）和氨基化合物（蛋白质）所发生的反应。美拉德反应不仅能显著改善食物的特性，如风味、色泽等，同时美拉德反应产物( Maillard reaction products，MRPs)还具有一定的抗氧化活性，有些产物甚至可媲美于食品中常用的抗氧化剂。不仅如此，MRPs还具有一定的细胞活性（细胞抗氧化等），有研究发

现人参皂苷与丝氨酸反应产物( MRPs)就具有很强的自由基清除能力，并且还具有保护肾上皮细胞免受铂诱导细胞损伤的活性。另外，Hao等研究也发现不同种类的糖与酪蛋白反应产物( MRPs)具有抑制偶氮二异丁脒盐酸盐( Azo two isobutyl acetamipridhydrochloride．AAPH)损伤Caco-2细胞的活性。

 目前，对于烤鸭的研究大多集中于香气成分的分析，研究发现烤鸭的主要香气成分为醛类、吡嗪类、呋喃类（糠醛、2-戊基呋喃）和噻唑类。这些物质中也不乏有美拉德反应产生的香气成分。现今，对于烤鸭水溶性提取物的活性研究并不多见，且对于肉制品活性成分提取方法的应用更是少之又少。Broncano等采用样品水溶提取、离心、过滤、滤膜除盐以及膜超滤（3 kDa以下）等方法提取了发酵香肠中低分子的抗氧化活性物质。Gu等利用超滤、凝胶色谱分离了酪蛋白一葡萄糖模式美拉德反应产物。Zhou等利用水溶提取、凝胶分离制得的烤鸭的水溶性粗提物及其分离组分具有一定的生物活性（抗氧化活性），同时液相色谱分析结果发现提取物中含有糠醛、HMF和吡嗪等美拉德反应产物。因此可认为水溶提取、凝胶分离的方法可以获得含有MRPs的烤鸭水溶性提取物。针对上述研究现状，试验开展了对烤鸭水溶性生物活性物质的提取分离及细胞抗氧化活性的研究。

1  材料与方法

1.1材料与试剂

 烤鸭：上海市售；噻唑蓝( MTT)：Sigma公司；人体胃癌细胞（MGC-803）：中国科学院细胞库；RPMI1640细胞基础培养液、胎牛血清：HyClone公司；总蛋白、丙二醛( Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶( Superoxide Dismutase，SOD)、一氧化氮( Nitric Oxide，NO)、一氧化氮合成酶(NitricOxide Synthase，NOS)测定试剂盒：南京建成生物工程公司；Sephadex G-15:上海宝曼生物科技有限公司。

1.2仪器与设备

  凝胶层析装置：上海青浦沪西仪器厂；多功能酶标仪( Infinite M200 Pro)：Tecan公司；倒置显微镜( IX71)：Olympus公司；紫外分光光度计( UV2600)：岛津企业管理（中国）有限公司。

1.3试验方法

1.3.1烤鸭水溶性粗提物的制备及纯化

 称取一定量的烤鸭水溶性粗提物，配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液。采用Sephadex G-15( 1.5 cm×40 cm)凝胶过滤层析，紫外检测器检测波长为280 nm，洗脱液为超纯水，流速1 mL/min，分部收集器收集后，低温浓缩、冷冻干燥后（烤鸭水溶性纯化物）冷藏待用。

1.3.2细胞培养

 人体胃癌细胞（MGC-803）于5% CO2、37 0C的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d更换一次新鲜培养液。进行细胞试验时，需利用血球计数板调整细胞浓度后进行试验。

1.3.3烤鸭水溶性纯化物对细胞增殖能力及细胞内活性指标（SOD，MDA，NO和NOS）的影响

 参照LV等的方法，细胞以4×105个/mL接种于96孔板，每孔200 μL。试验组分别添加不同质量浓度的样品培养液（0.5，1，2和4 mg/mL），培养24 h后，MTT法测定烤鸭水溶性纯化物对细胞增殖能力的影响。细胞以2 x 104个/mL接种于12孔板，添加最优浓度的样品培养液培养细胞24 h，终止培养后，吸尽培养液，用PBS清洗。利用-80℃低温冰箱反复冻融细胞获得裂解液，根据试剂盒说明书测定蛋白含量及细胞中SOD，MDA，NO和NOS等活性指标的活力和含量。

1.3.4细胞氧化损伤模型的建立

 1) H2 O 2细胞损伤试验。细胞接种于96孔板，每孔200μ L。分别加入含有不同浓度H2 O 2的新鲜培养液，利用MTT法测定细胞增殖率，选取IC50浓度的H2O2进行细胞损伤保护作用的试验。

 2)分离物对H2O2氧化损伤细胞保护作用的研究。细胞接种于96孔板，空白对照组：细胞不做任何处理；损伤组：加入合适浓度的H2O2损伤细胞；加样组：分离组分D3培养细胞22 h后加入合适浓度的H2O2损伤，MTT法测定细胞增殖率。

2试验结果与讨论

2.1凝胶层析

 图1为粗提物( D0)经凝胶色谱分离得到4个组分，分别命名为D1，D2，D3和D4。如图所示，根据出峰的先后顺序可知分离物各组分分子量大小顺序为D1> D2> D3> D4。

2.2烤鸭水溶性纯化物细胞抗氧化活性的研究

2.2.1对细胞增殖能力及细胞中活性指标的影响

 图2为MTT法测定的不同质量浓度(0.5，1，2和4 mg/mL)烤鸭水溶性纯化物对MGC-803细胞增殖能力的影响，由图2中可以看出，在一定浓度范围内样品对细胞增殖有显著的促进作用，其中D3作用尤其明显，且在质量浓度<2 mg/mL时，质量浓度越高，促进细胞增殖的效果越明显。

 图3是质量浓度为2 mg/mL时烤鸭水溶性纯化物对细胞内SOD，MDA，NO和NOS指标的影响，由图3可以看出，与对照组相比，经D3处理过的细胞MDA含量最低，SOD活性较对照组高，NO的含量、NOS的活力较对照组低，且均呈现显著变化。

2.2.2细胞氧化损伤模型的建立

 图4为水溶性纯化物D3对H2O2细胞损伤模型的细胞抗氧化活性影响。首先，由图4 (a)可知，随着浓度的增加，H2O2对细胞的损伤程度也不断增加，当浓度为25μmol/L时，细胞稳定性降到一半左右，因此选择25μmol/L的H2O2进行细胞损伤模型试验；其次，由图4(b)可知，不同浓度的D3均可减小H2O2对细胞增殖的抑制作用，使细胞存活率由41.1%增加到92.3%。结果表明，烤鸭水溶性纯化组分D3具有较好的细胞抗氧化活性。

3结论与讨论

 在正常的人体细胞中，细胞的氧化与抗氧化始终处于动态平衡之中。该平衡一旦被打破，活性氧( Reactive oxygen species，ROS)就会增多而攻击细胞磷脂层中的多不饱和脂肪酸，最终产生MDA，加剧氧化损伤细胞而导致细胞凋亡；不仅如此，细胞除了受刺激产生ROS外，还能自分泌一定量的ROS。同时细胞中也存在多种清除ROS的酶，如SOD等，也会不断地清除活性氧。TNOS代表细胞中总NOS，包括TNOS（原生型酶）和TNOS（诱导型酶），细胞中NOS酶是NO合成的关键酶，在受到外界刺激时，体内的细胞如肝细胞、巨噬细胞等可表达TNOS，而产生远高于生理量的NO，抑制能量代谢及干扰糖酵解、三羧酸循环引起细胞凋亡，因此一氧化氮合酶( NOS)同样也是检测细胞活力及损伤的重要指标。试验结果表明烤鸭水溶性粗提物和凝胶层析纯化的4种组分均具有提高细胞活力及细胞内抗氧化酶( SOD)活性的能力，同时也可减低细胞内MDA的含量，其中组分D3的作用最为明显。D3是通过提高细胞中SOD的酶活、降低细胞自分泌的ROS、减少自由基和细胞中MDA的含量，从而提高细胞增殖能力（活力）。朱振勤等研究发现10μg/m L的白芦藜醇培养细胞后，可使细胞内源SOD活性升高(200.2%)，可使Hela细胞内自分泌的总ROS浓度降低(46.5%)，进而确定了白芦藜醇的细胞抗氧化功能。H2O2细胞损伤模型试验也说明组分D3确实对H2O2损伤细胞具有保护作用，即表现出良好的细胞抗氧化能力。

 烤鸭水溶性粗提物和凝胶层析纯化物所具有的细胞抗氧化活性，主要来自烤制过程中所产生的美拉德反应产物，即MRPs具有一定的细胞抗氧化活性。这一结果与大米淀粉与葡萄糖等价物及葡萄糖反应产生的MRPs对H2O2损伤Caco-2细胞的保护作用有许多的相似之处，其机理主要为抑制细胞凋亡因子，增强细胞内抗氧化酶的活性两个方面。同时又与Esmaeili

等研究的鼠尾草提取物细胞抗氧化机理相一致，即测定提取物培养细胞后细胞内SOD等活性指标的变化，证实了提取物是通过提高细胞活力及细胞内抗氧化酶的活性（SOD活性提高66.7%）来发挥细胞抗氧化功能，进而保护细胞免受氧化损伤。试验对进一步研究烤鸭中的生物活性物质提供了有利的理论依据。