作者：郑晓敏

     提示: 本研究实验结果表明，当铜绿微囊藻受到Ni2+协迫时，叶绿素a含量显著下降，其他研究结果也表明Ni2+能抑制铜绿微囊藻和集胞藻的光合色素合成；As3+加人后叶绿素a含量明显低于对照，但在低浓度范围内有一定的升高，随后高浓度又开始下降，Mascher等对红三叶草的研究也发现．低浓度砷处理时，植物的光合色素含量均有所提高．说明铜绿微囊藻和植物对低浓度的砷有一定的耐受佳，随着砷浓度的增加，毒害作用趋于明显。

    研究表明，水体中的Ni2+对M. aerugonisa的生长有抑制作用，降低叶绿素a和藻蓝蛋白的含量，破坏电子传递链，导致ROS的产生。而砷通过磷转运途径进入细胞污染物能够引起反常的皮肤、肠胃、神经问题，甚至能够致癌。但Ni和As等重金属污染物具有生物富集和积累的性质，研究快速其快速检测方法，对于了解其对细胞的伤害，有重要指示作用。

    作为水体生态系统的初级生产者，铜绿微囊藻是一种常见的水华藻类，对污染物的胁迫反应敏感，可以很好地反映水体污染的程度。关于重金属对铜绿微囊藻胁迫的研究在国内外已有大量的文献报道，但对于叶绿素荧光技术的应用较少。目前，叶绿素荧光动力法具有快速、灵敏、对细胞无损伤且便于操作携带等优点而得到了广泛的使用。叶绿素光诱导荧光作为光合作用的探针，与PSⅡ反应中心及反应中心电子供体侧和受体侧氧化还原状态密切相关，能提供大量光合系统功能的信息。因此，本文利用快速叶绿素荧光动态分析技术，探讨镍和砷的胁迫下，铜绿微囊藻的光合作用色素含量和叶绿素光诱导荧光动力学特征的变化，同时分析镍和砷作用在铜绿微囊藻电子传递链位点，对于分析不同重金属污染的特性，并应用于污染物的环境监测中，有重要意义。

1材料与方法

1.1实验材料

    铜绿微囊藻（M. aeruginosa）藻种来源于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻类藻种库( FACHB)，无菌操作将藻种转接至新鲜灭菌过的BG-11培养基内，于光照培养箱中恒温(20±1)℃，光强50 μE/(m2·s)，24 h持续光照培养至对数期。

1.2实验方法

1.2.1镍和砷对铜绿微囊藻的处理方法

    将培养至对数期的铜绿微囊藻无菌操作转移至灭菌过的250 mL锥形瓶中，然后加入NiS04·6H2O，使Ni2+的终浓度为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/L，藻液密度为8.lxlOs个/mL，分别在0，24，48，72，96 h，测定铜绿微囊藻的叶绿素a含量和荧光参数。

    将培养至对数期的铜绿微囊藻无菌操作转移至灭菌过的250 mL锥形瓶中，然后加入As302，使As3+的终浓度为0、0.5、l、2、3、5 mg/L，藻液密度为8.lx105个/mL，分别在0，24、48、72、96 h，测定铜绿微囊藻的叶绿素a含量和荧光参数。

1.2.2叶绿素a的测定

    叶绿素浓度的测定参照李合生等的方法。取5 mL处理后的藻液，8 000 r/min离心10 min后弃上清，收集藻体，加入等体积的95%乙醇，置4℃冰箱放置24 h，中间摇晃2—3次，离心(8 000 r/min，10 min)，用UV-2000型分光光度计在665 nm和649 nm波长下测定离

心后上清液的光密度值D666和D649，用公式C=13.7×D666 - 5.76×D649计算叶绿素a浓度，单位为μg/mL。

1.2.3荧光参数测定

    取经不同浓度Ni2+和As3+处理后的铜绿微囊藻培养物2 mL，暗适应15 mm，采用叶绿素荧光动力学参数采用便携式植物效率分析仪(PEA，HanasatechR．U．K)于室温下测定，激发光强为最大光强的50%(约1 500 μE/(m2·s))，记录时间为5s。叶绿素荧光诱导动力学曲线反应了电子传递链参数的变化，除O-J-I-P的变化情况外，还可得到大量关于电子传递情况的原始数据，处理后可获得关于PSII反应中心原初光化学反应的各种信息，各参数具体含义见表1。

1.2.4数据分析

    本文所有数据是多次平行实验结果，取平均值，用origin作图，并用One-Way ANOVE进行显著性分析。

2结果与分析

2.1  不同浓度镍和砷对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

    如图l所示，在加入Ni2+后，随处理时间的延长及Ni2+浓度升高，叶绿素a含量显著降低(p<0.05)；在处理l d时各处理组的叶绿素a含量均显著低于对照组，在加入Ni2+后4 d，0.1 mg/L Ni2+处理组的叶绿素a含量比同期对照组降低56.5%，l mg/L Ni2+处理组降低了97.2%。在加入As3+后，随处理时间的延长及浓度升高，叶绿素a含量仍然升高(p<0.05)，各处理组叶绿素a含量低于对照组，但各处理组除2 d时差异显著外．其他并不显著，如在加入As3+后4d时，0.5、l，5mg/L处理组的叶绿素a含量比同期对照组降低36.3%、22.4%、29.0%。结果表明Ni2+比As3+的作用效果明显。

2.2  不同浓度镍和砷对铜绿微囊藻光合活性(Fv/Fm)影响

    如图2所示，在加入Ni2+后，随处理时间的延长及Ni2+浓度升高，FV/Fm显著降低；在处理l d时各处理组的Fv/Fm即显著低于对照组，在加入Ni2+后4d，Fv/Fm值极显著降低(p<0.01)。在加入As3+后，随处理时间的延长及浓度升高,Fv/Fm仍然升高，但各处理组Fv/Fm低于对照组，各处理组除2d时差异显著外，其他处理

时间并不显著(p>0.05)。结果表明Ni2+比As3+对光合活性的作用效果要明显。

2.3不同浓度镍和砷对铜绿微囊藻叶绿素荧光动力曲线的影响

    由图3可以看出，在经过Ni2+和As.3+处理后，铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度和诱导曲线的不同相均发生了变化。在加入Ni2+第1天时铜绿微囊藻的荧光强度均显著(p<0.05)降低，低浓度(<0.8 mg/L)处理组诱导曲线的J点和P点均显著下降但并未消失，高浓度处理组的J点和P点基本消失，在经过Ni2+处理4d时荧光强度显著降低，J相和P相均已基本消失，表明电子传递链受损严重。在加入As3+后ld时铜绿微囊藻的荧光强度均降低，各处理组的J相和P相均变弱，在加入As3+后4d时低浓度处理组的荧光强度低于对照组，J相和P相都得到一定恢复，表明As3+导致电子传递链受阻但并未中断。

2.4不同浓度镍和砷对铜绿微囊藻光合电子传递链参数的影响

    快速叶绿素诱导动力学曲线的光化学性能参数中包含的3个参数pDo、RC/CSo和ETo/ABS反映了植物光合机构的状态和胁迫对光合机构的影响。在加入外源不同浓度Ni2+和As3+离子处理后，发现铜绿微囊藻的PSII反应中心受体侧电子传递链受阻，反应中心活性降低，热耗散增加（表2）。在处理4d后，Ni2+处理组铜绿微囊藻各光合参数继续降低，但As3+处理的RC/CSo则升高，表明单位面积内反应中心的数量增加，说明在适应As3+处理一段时间后，铜绿微囊藻的适应能力增强。

3讨论

    在藻类和高等植物中，光合电子传递由2个光反应（PS I和PSⅡ）中心串联进行，在光合膜上PS I和PSⅡ通过包括质体醌(PQ)、Cyt b6/f复合体和质蓝素(PC)在内的一系列电子传递体连结在一起，电子传递过程中在光合膜两侧建立的质子梯度可以驱动ATP的合成。叶绿素荧光反映了植物光合系统功能的变化状况，如荧光参数值Fv/Fm的变化表明了PSⅡ原初光能转换效率能力的大小，pDo表示用于热耗散的量子比率，RC/CSo表示单位面积内反应中心的数量，ETo /ABS表示用于电子传递的量子产额等。

    在不同的环境条件下，O-J-I-P多相瞬态会改变形状并提供大量的光合系统功能状况的信息。因此，OJIP测定已经被广泛应用于不同胁迫下各种光合放氧生物的研究。本文的研究结果发现，Ni2+胁迫下铜绿微囊藻PSⅡ活性（Fv/Fm)呈现显著下降趋势，OJIP曲线形状发生改变，当Ni2+浓度达到0.8mg/L时，J相和P相已基本消失，pDo、RC/CSo以及ETo/ABS的变化（表2）均表明反应中心受体侧电子传递链受到损伤，反应中心活性下降。Huang等的研究也表明，Ni2+胁迫铜绿微囊藻会导致ROS的增加，而大量的ROS会破坏细胞膜结构并引起DNA的损伤，从而影响光合系统的功能。As3+胁迫铜绿微囊藻时，低浓度处理组的PSⅡ活性有所上升，高浓度下降，与叶绿素a含量的变化趋势基本一致，表现了铜绿微囊藻对低浓度As3+迫的耐受性。有大量的文献报道，蓝藻中存在类金属硫蛋白使得藻细胞对低浓度的重金属有一定的抗性，而砷可以诱导金属硫蛋白的产生。因此本研究中铜绿微囊藻对低浓度的砷有一定的耐受性可能是因为藻细胞被砷诱导出类金属硫蛋白，从而使其对低浓度的砷表现出一定的抗性。As和P都是第V主族元素，因此As034-在结构上与P034-艮相似，可以通过磷转运途径进入细胞。活体条件下氧化磷酸化和光合磷酸化的共同点是ATP合成均与电子传递偶联，也就意味着若缺乏ATP的合成，电子传递就会受到限制，因此在As3+胁迫下铜绿微囊藻的光合活性降低可能是由于As3+进入磷转运而导致ATP合成受到破坏，从而使电子传递链受到损伤。