作者：胡晓辉   

   白筋(Acanthopanax trifoliatus(L．)Merr)，又称鹅掌、三叶五加、筋菜等，为五加科五加属灌木植物；白簕为传统的民间药食同源植物，国内广泛分布于广东、四川、贵州、台湾等地，日本、越南和菲律宾亦有。白簕含有黄酮、多酚、皂苷、挥发油、多糖等活性成分。《明·食物本草》记载：“五加，叶作蔬食，去皮肤风湿”，《中国高等植物图鉴》记载：  “簕菜味苦、辛、凉，具有清热解毒、祛风利湿、舒筋活血、止咳平喘之功效”。试验对簕菜进行了深入系统的研究，分离一系列活性成分，前期活性研究结果表明白筋提取物具有很好的抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性。近年来对植物多酚的大量研究表明，多酚具有很好的抗氧化活性。试验首次以白筋茎叶为研究对象，对白簕总多酚的提取工艺进行优化并研究其抗氧化活性，为白簕的开发利用提供科学理论依据。

1  材料与仪器

    白筋：由广东恩平李雪壮筋菜茶厂种植基地提供，5月采收，经广东省广州市华南植物园叶华谷研究员鉴定为五加科植物白簕。没食子酸标准品、水溶性维生素E( Trolox)标准品、福林-酚试剂(FC)、

1，1--苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-联氮一二3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐(ABTS)、2，4．6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2，2’-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐( AAPH)：Sigma公司；其他试剂均为分析纯：广州化学试剂厂。

    Lambda 25紫外-可见分光光度计：珀金埃尔默（上海）有限公司；Tecan Infinite F200 PRO-滤光片型多功能酶标仪：帝肯（上海）贸易有限公司；HH-S型水浴锅：郑州长城科工贸易有限公司； ML204/02型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

  2试验方法

  2.1  白簕总多酚含量和提取率的测定

    精密称量4 mg没食子酸，用水溶解定容至100 mL，分别移取0，0.125，0.250, 0.500, 0.750, 1.000和1.200 mL于0～6号10 mL具塞试管中，用去离子水定容到2 mL，加入0.25 mL稀释1倍的福林酚试剂，静置6 min后，加入2.5 mL的7% Na2C03溶液，用去离子水定容到6 mL，室温静置90 min后以0号试管作为空白参照，于760 nm测其吸光度。以吸光度为y值；以没食子酸标准品质量浓度( mg/L)为x值，绘制标准曲线。线性回归方程为：

y=0.105 6x-0.001 5(R2=0.999 5).

    测定各提取液吸光度，并根据回归方程计算白簕总多酚得率（以没食子酸计）。

    M=C×V×N/m×100%    (1)

    式中：M-白筋总多酚得率，mg/g; C-根据标准曲线计算出待测液中总多酚含，mg/mL; V-待测液体积，mL; N-稀释倍数；m-白簕于粉质量，g。

2.2  白筋总多酚的提取工艺研究

    取新鲜白簕茎叶经清洗，沥水后，50℃下干燥至恒重，粉碎，过60目筛，精密称取白簕粉2g，按一定液料比值例加入乙醇溶液，加热恒温提取一定时间，减压抽滤后定容到50 mL的容量瓶中备用。首先，对乙醇体积分数（15%，35%，55%，75%和95%），提取时间（30，60，120，180和240 min），提取温度（50 0C，60 0C，70 0C，80℃和90℃）和液料比值（10，15，20，25和30（mL/g））进行单因素考察。然后以乙醇体积分数、提取时间、提取温度和液料比值为考察因素，采用Design Expert软件的Box-Behnken模型响应面方法进行四因素三水平试验，因素水平表见表1。

2.3体外抗氧化活性测定

2.3.1  DPPH自由基清除能力

    白筋多酚提取液和标准品Trolox母液分别稀释成合适的浓度梯度，吸取不同浓度的白簕多酚提取液和Trolox溶液2 mL，加入2 mL已配好的DPPH溶液(0.16 mmol/L)，混合摇匀作为试验组，以2 mL无水乙醇加入2 mL DPPH溶液作为空白对照。室温放置暗处30 min后，在517 nm处测定吸光度，计算清除率。

    DPPH自由基清除率=（1-A试验组/A空白组）×100%

    (2)

2.3.2 ABTS自由基清除能力

    白簕多酚提取液和标准品Trolox母液分别稀释成合适的浓度梯度，吸取不同浓度的白筋多酚提取液和Trolox溶液400 uL样液加入3.6 mL ABTS溶液，混匀作为试验组，以无水乙醇作为空白对照。30 aC水浴锅中反应6min，于波长734 nm下测其吸光度，计算清除率。

    ABTS自由基清除率=（1-A试验组/A 空白组）×100%

    (3)

2.3.3  0RAC抗氧化能力

    参照文献的方法测定，并进行适当修改。白簕多酚提取液和标准品Trolox溶液用75 mmol/L磷酸盐缓冲液( pH 7.4)进行稀释。取20uL适当浓度的白筋多酚提取液或者20 uL标准品Trolox溶液(5～50 umol/L)，和120uL 荧光素钠溶液(136 nmol/L)加入96孔酶标板中，在荧光酶标仪中于37 0C温育20 min，每个孔再加入60 uLAAPH溶液(40 mmol/L)，短时振荡后在波长485 nm处激发，每2 min在波长535 nm处释放测定荧光强度，设置测定时间120 min。ORAC抗氧化能力以每毫克提取物的多酚对应的Trolox当量表示

  ( mg TE/mg)。

  3结果与分析

  3.1单因素试验结果与分析

    分别选择乙醇体积分数、提取时间、提取温度和液料比值为因素，单因素试验分析白筋总多酚得率结果如图1。

    由图1 (a)可知，固定其他因素，乙醇体积分数在15%~55%时，提取得率呈升高趋势达到54.85 mg/g，总多酚得率随乙醇体积分数增加而增加，由于多酚在植物体内通常与蛋白质，多糖以氢键和疏水链形成稳定的分子复合物，而乙醇通过断裂氢键作用，提高总多酚得率。在55%～95%时呈降低趋势，提取液中溶出较多醇溶性杂质和亲脂性强的化合物，这些化合物与多酚类物质竞争乙醇分子，并且组织的通透性下降，导致多酚得率下降。

    从图1 (b)可知，固定其他因素，随提取时间的增大，白筋总多酚得率先增加后减小，在120 min时达到最大值58.50 mg/g。由于大分子物质氢键和疏水作用力的破坏需要时间，在一定范围内，总多酚得率随提取时间的增加而增多。提取时间过长时，多酚与氧气接触而分解或乙醇挥发而极性降低，总多酚得率减少。

    从图1 (c)可知，固定其他因素，白筋总多酚得率随提取温度的增加先升高后降低，在70℃时达到最大值56.35 mg/g，随后温度升高，得率反而降低。在较低温度范围内，醇溶液中多酚运动速度随温度升高而增大，加速其从细胞中溶出而提取得率提高，但是温度过高会破坏多酚的结构，乙醇也会加速挥发而不利于提取。

    从图1 (d)可知，固定其他因素，随液料比值的增大，白筋总多酚得率变大，说明增大溶剂比例，有利于多酚的溶出，提高总多酚得率，当液料比值达到25（mL/g）时，总多酚得率趋于稳定，多酚物质已溶出完全。

3.2  Box-Behnken设计试验结果与分析

    利用Design-Expert 8.0.6软件，对白筋总多酚得率显著影响因素进行响应面分析，Box-Behnken试验设计及结果见表2，得到白筋总多酚得率(Y)对乙醇体积分数(A)、提取温度(B)、提取时间(C)和液料比值(D)的多元二次回归模型方程式：

Y=61.95+0.3 8A+3.80B-0.57C-0.034D+0.35AB+0.50AC+

0.078AD+0.43 BC+O.10BD+1.49CD-2.79A2-3.44B2-0.83C2-1.84D2。

    利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行响应面分析，得出回归模型参数的方差分析见表3。由方差分析可知，模型的p值显著，模型的相关系数R2=0.994 2，失拟项(p=0.457 1>0.100 0)不显著，说明该方程与试验的拟合度好。其中，极显著项(p<0.01)有A, B, C, CD, A2, B2, C2, D2。显著项(p<0.05)有AC，BC，在所选取的各因素水平范围内，单因素的影响顺序为提取温度(B)>提取时间(C)>乙醇体积分数(A)>液料比值(D)。各因素交互作用中，三组变互项CD，AC和BC对Y有显著影响(p<0.05)，其中CD对Y影响极为显著( p<0.001)，图2～4分别对应其响应面图和等高线图，从图中可直观地反映出这三组交互项之间对总多酚得率存在比较显著的交互作用。

3.3最佳条件的确定及验证试验

    由Design-Expert 8.0.6软件分析得，当乙醇体积分数为55.35%，温度为74.79℃，提取时间为113.31 min，液料比值为25.05( mL/g)时，白筋总多酚得率的预测值为63.01 mg/g。结合实际情况确定白筋总多酚的提取工艺条件：乙醇体积分数为55%，温度为75℃，提取时间为113 min，液料比值为25( mL/g)，以此条件进行提取，重复3次试验，得到总多酚得率的实际值为62.71±1.48 mg/g，该值与理论预测值基本吻合，说明该模型具有较好的分析能力，证实试验优化得到的工艺参数基本可靠，重现性较好。

3.4  白簕总多酚的抗氧化活性评价

    由图5可见，白筋总多酚和Trolox的自由基清除能力呈现明显的浓度依赖性，两者对DPPH自由基清除的IC50值分别为5.33 ug/mL(y=9.460 7x-0.424 4，R2=0.997 5)和4.63 ug/mL(y=10.809x-0.002 1,R2=0.999 0)，说明白筋总多酚DPPH自由基清除能力接近Trolox，而对ABTS自由基清除的IC50值分别为6.60ug/mL(y=8.503 3x-6.136 6.R2=0.996 7)和10.03ug /

mL（y=4.919 8x+0.672 1，R2=0.997 7），结果表明白筋总多酚ABTS自由基清除能力高于Trolox。此外，ORAC抗氧化能力标准曲线(y=1.292 Sx+3.384 1，R2=0.997 0，其中y为净面积，x为Trolox质量浓度)，测定出白簕总多酚的ORAC抗氧化能力为1.30±0.31 mg TE/mg。三种活性评价结果表明，白筋总多酚成分具有和Trolox相当甚至更好的抗氧化活性，用于食品品质维持和功能食品开发前景广阔。

4结论

运用Design-Expert 8.0.6软件优化乙醇体积分数，提取温度，提取时间和液料比值对白簕总多酚得率的影响，得到最优提取条件：乙醇体积分数为55%，温度为75℃，提取时间为113 min，液料比值为25（mL/g）。在此条件下，白簕总多酚得率的实际值为62.71±1.48 mg/g，该值与理论预测值63.01 mg/g基本吻合。响应面法所得的优化提取条件工艺参数可靠，可行性强，可为白簕多酚产品的开发利用提供科学依据。通过DPPH，ABTS和ORAC方法的活性评价结果表明，最优提取条件下白簕总多酚具有较强的抗氧化活性。  

5摘要 

 以白簕为原料，研究白簕总多酚的提取工艺，并研究其抗氧化活性。在单因素基础上，采用Box-Behnken响应面法对提取工艺进行优化，所得最佳工艺参数：乙醇体积分数为55%，温度为75℃，提取时间为113 min,液料比值为25 (mL/g)。买际测得总多酚得率62.71±1.48 mg/g，与理论值基本吻合。通过DPPH, ABTS和ORAC测定的研究结果表明，白簕总多酚具有与Trolox相当甚至更好的抗氧化活性。