刘茜茜，张秀玲*，谢凤英，杜敏，孙瑞瑞，程雪

 东北农业大学食品学院（哈尔滨150030）

摘要利用Design Expert 8.0软件测定柠檬酸，VC和CaCl2_种护绿剂对刺老芽灭酶过程中叶绿素含量的影响及三种护绿剂的交互作用。试验选取的三种护绿剂均为食品级试剂、无重金属，实现了对刺老芽安全、高效护绿的目的。通过单因素及响应面的试验结果得出在微波灭酶功率为560 W，灭酶时间为1min的条件下，利用Design Expert8.0软件-对其进行优化，得到三种护绿剂的最佳复配比为：柠檬酸质量浓度1.37 g/L，VC质量浓度2.07 g/L，CaCI2质量

浓度1.08 g/L，此条件下刺老芽叶绿素含量的预测值为3.314 5 mg/g。

关键词刺老芽；叶绿素；护绿：优化

  刺老芽是主要分布于中国东北地区的一种山野菜，营养丰富，富含16种氨基酸和22种微量元素，刺老芽中的钙、锰、铁、钛、镍、铜和锗等元素的含量甚至高过人参高，因此被誉为“天下第一山珍”，目前国际市场对刺老芽的估价为每吨1万元以上。但是由于刺老芽天然野生的量非常少，季节性非常强，采摘后非常容易出现黄化、萎蔫的现象，限制了其进一步的加工及出口。因此研究如何延缓刺老芽的黄化、萎蔫问题，延长其保鲜贮藏时间，成为刺老芽进一步加工的首要问题，目前国内外关于这方面的研究相对较少。

  试验利用微波灭酶技术，选取柠檬酸、VC和CaCI2三种食品级护绿剂，利用Design Expert 8.0软件对刺老芽的护绿剂浓度进行优化，以实现刺老芽安全高效的护绿目的。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料

  刺老芽：采摘于东北农业大学园艺学院山野菜培养棚。

1.1.2试验试剂

 柠檬酸、VC、CaCI2:分析纯试剂，购自哈尔滨市德美实验仪器经销有限公司；95%乙醇：购自哈尔滨市德美实验仪器经销有限公司。

1.1.3主要仪器与设备

  721型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；YP20002电子天平：上海越平科学仪器有限公司；G70D20CNIP-D2( SO)格兰仕微波炉：格兰仕微波生活电器有限公司

1.2试验方法

1.2.1试验流程

1.2.2预处理

 将采摘后新鲜的刺老芽，去除老化部位保留新鲜的枝叶，清洗去除表面的杂质，晾干备用。

1.2.3微波灭酶

  将原料放入纯净水中，比例为1：100 g/mL。选择柠檬酸、VC和CaCl2三种护绿剂，柠檬酸试验浓度范围为0.30～2.30 g/L，VC试验浓度范围0.50~2.50 g/L，CaCl2试验浓度范围0.50～2.50 g/L。在单因素结果的基础上，利用Design Expert 8.0软件对试验进行交互设计，按照试验设计配置护绿液，利用微波技术对菜体灭酶，微波功率为560 W，时间为1 min。

1.2.4叶绿素测定

 采用分光光度法测定处理后样品的叶绿素含量。具体步骤：在分析天平上称样1 g置研钵中，加入少量95%乙醇，加入少量石英砂、碳酸钙粉末，研磨至叶片组织变白即可，并静置3～5 min。过滤，用少量95%乙醇冲洗研钵2～3次转入容量瓶，容至50 mL，摇匀。利用721分光光度计652 nm波长下测定吸光度，并根据公式计算叶绿素总含量值，重复3次取平均值。

1.2.5试验结果统计方法

 在单因素结果的基础上，利用Design Expert 8.0软件进行试验设计、模型建立及结果分析等。

2结果与分析

2.1单因素试验

 试验选用柠檬酸的用量分别为0.30，0.80，1.30，1.80和2.30 g/L 5个质量浓度梯度，VC的用量分别为0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 g/L 5个质量浓度梯度，CaCl2的量分别为0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 g/L 5个质量浓度梯度。

2.1.1柠檬酸浓度对刺老芽叶绿素含量的影响

 图1为柠檬酸质量浓度在0.30～2.30 g/L范围内变化对刺老芽叶绿素含量影响的折线图。由图1可知，在试验选取的浓度范围内随着柠檬酸浓度的增加，刺老芽叶绿素的含量先上升后下降，当柠檬酸质量浓度为1.30 g/L时，刺老芽叶绿素含量达到最大值，为2.749 4mg/g。因此在试验选取的范围内，最适的柠檬酸质量浓度为1.30 g/L，当柠檬酸浓度超过一定值时，溶液pH会偏低，刺老芽叶绿素结构中的卟啉环与Mg2+的结合不稳定，叶绿素发生脱镁反应，Mg2+被H+取代形成脱镁叶绿素，刺老芽的颜色会由鲜绿色转变成橄榄绿，暗绿甚至褐色，不利于刺老芽的护绿。

2.1.2  VC浓度对刺老芽叶绿素含量的影响

 图2为VC质量浓度在0.50～2.50 g/L范围内变化时对刺老芽叶绿素含量影响的折线图。由图2可知，在试验选取的浓度范围内随着VC浓度的增加，刺老芽叶绿素的含量先上升后下降，当VC质量浓度为2.00 g/L时，刺老芽叶绿素含量达到最大值，为2.478 6 mg/g。VC是一种水溶性的抗氧化剂，可以抑制叶绿素氧化分解。在试验的浓度范围内，在VC浓度达到一定值前，随着VC浓度的增加，刺老芽叶绿素的含量逐渐的增加，但VC浓度超过一定值时，刺老芽叶绿素的含量缓慢下降，这可能是因为VC的水溶液呈酸性，达到一定浓度后，溶液pH过低，破坏了刺老芽叶绿素的结构，使其含量下降。

2.1.3  CaCl2浓度对刺老芽叶绿素含量的影响

 图3为CaCI2质量浓度在0.50～2.50 g/L范围内变化时对刺老芽叶绿素含量影响的折线图。由图3可知，在试验选取的浓度范围内随着CaCl2浓度的增加，刺老芽叶绿素的含量先上升后下降，当CaCI2质量浓度为1.00g/L时，刺老芽叶绿素含量达到最大值，为2.436 4 mg/g。CaCl2是一种典型的离子型卤化物，一定条件下可以取代脱镁叶绿素分子卟啉环中的氢离子，生成稳定的叶绿素金属离子络合物，起到一定的护绿作用，除此之外Ca2+还可以起到保脆的作用。在试验的浓度范围内，当CaCl2浓度超过一定值时，刺老芽叶绿素的含量缓慢下降，这是因为CaCl2溶于水时释放大量的热，可能对刺老芽中叶绿素含量造成了负面的影响。并且CaCl2的水溶液呈微酸性，达到一定浓度后，也可能会破坏刺老芽叶绿素的结构，使其含量下降。

2.2响应面对三种护绿剂复配护绿的优化

2.2.1  响应面试验设计及结果分析

 基于单因素试验的结果，选取柠檬酸、VC和CaCl2的浓度为变量，刺老芽叶绿素含量为响应值，利用Design Expert 8.0软件进行响应面分析设计和试验（表1），进一步优化各因素的参数值。选择中心复合模型，做3因素3水平总共17个试验的响应面分析试验。

  采用Design Expert 8.0软件对试验数据进行回归分析，得出多元二次回归拟合方程为：刺老芽叶绿素含

 利用Design Expert 8.0软件对试验结果进行分析，根据表3试验结果可知，A2、B2和C2对刺老芽叶绿素含量影响极显著，AB、AC和BC之间的交互作用对刺老芽叶绿素含量影响极显著。

 从表3中可以看出，试验得出的二次回归模型极显著( p<0.000 1)；回归方程的复相关系数为0.999 994，表明99.99%的刺老芽护绿可以由此模型解释；校正相关系数为0.999 987，预测相关系数为0.999 919，二者数值接近并且与复相关系数数值十分接近，说明模型理想；回归模型的变异系数为0.037 018，变异系数低，说明模型的置信度较高；信噪比为967.413 5，远大于4，说明模型十分理想。综上所述，该回归方程为刺老芽护绿提供了一个合适的模型，因此，可用上述模型代替真实试验点对刺老芽护绿进行分析和预测。

2.2.2响应面分析

 对刺老芽交互护绿的结果显示，柠檬酸与VC、柠檬酸与CaCI2、VC与CaCl2之间交互作用都极显著，采用Design Expert 8.0软件对回归模型进行规范分析，柠檬酸与VC、柠檬酸与CaCl2、VC与CaCl2交互作用对刺老芽叶绿素含量影响的等高线图和响应面图具体见图4~图6。

等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱，等高线呈图圆形表示两因素交互不显著，椭圆表示较为显著。当微波灭酶功率，灭酶时间处于固定条件时，由图4~图6可以非常直观的得出柠檬酸与VC、柠檬酸与CaCl2、VC与CaCl2的交互作用对刺老芽叶绿素含量影响显著，表现在响应曲面比较陡峭。柠檬酸与VC、柠檬酸与CaCl2、VC与CaCl2的交互作用中，叶绿素含量均随着护绿剂含量的增加先显著增加，而后显著下降。当交互的两种护绿剂浓度达到适宜的配比时，刺老芽中叶绿素含量最大，即为最佳的交互浓度。根据Design Expert 8.0软件中多元二次回归拟合方程得出当微波灭酶功率为560 W，灭酶时间为1 min的条件下，三种护绿剂的最佳复配比为：柠檬酸质量浓度1.37 g/L，VC质量浓度2.07 g/L，CaCI2质量浓度1.08 g/L。

2.2.3验证试验

 当在微波灭酶功率为560 W，灭酶时间为1 min时，利用Design Expert 8.0软件得出的最优护绿复配剂的比例为柠檬酸质量浓度1.37 g/L，VC质量浓度2.07g/L，CaCl2质量浓度1.08 g/L。按照护绿复配剂最优比进行试验来验证是否符合模型方程式预测的最佳响应值，试验测得叶绿素含量结果见表4。

3结论

 1)试验选取柠檬酸、VC和CaCl2一种食品级护绿剂对刺老芽进行护绿，在单因素结果的基础上，利用Design Expert 8.0软件进行三因素三水平的优化组合，得出了柠檬酸、VC和CaCI2三种护绿剂之间存在显著的交互作用。并建立了显著的二次回归模型，回归方程为：

 方差分析表明，回归模型拟合检验极显著，因此该方程能较好地反应刺老芽叶绿素含量随柠檬酸、VC和CaCl2三种护绿剂浓度变化的规律。

 2)试验采用Design Expert 8.0软件对刺老芽叶绿素含量工艺参数进行优化。得出当在微波灭酶功率为560 W，灭酶时间为1 min的条件下，柠檬酸质量浓度为1.37 g/L，VC质量浓度为2.07 g/L，CaCl2质量浓度为1.08 g/L，刺老芽叶绿素的含量最高，即护绿条件最佳，预测值为3.314 5 mg/g，实际测定值与预测值近似。