罗明有1，游玲2，潘玲玲1，邱树毅1，王涛2，冯学愚3

 1．贵州大学（贵阳550025）；2．宜宾学院(宜宾644000)；3．成都师范学院（温江611130）

摘要采用平板透明圈法，从分离自浓香型白酒糟醅中的110株酵母中筛选到3株能在酸性条件下分解纤维素的菌株，对其进行系统发育分析，显示这3株酵母分别为Lodderomyces elongisporus和Debaryomyces hansenii;对其中1株酵母开展产酶条件的初步研究，表明在32 0C，pH 5.8的麦芽汁培养基中培养36 h，发酵液中纤维素酶活性高达1.84U．mL-1。

关键词  浓香型白酒；酵母菌；纤维素酶

  纤维素是重要的可再生资源，随着不可再生资源的日益枯竭，利用生物技术转化纤维素具有重大意义。纤维素的高效降解和利用一直是科研难题，其降解分为酸降解、碱降解、热降解、氧化降解和生物降解，其中生物降解是主要方向。

  微生物因其繁殖快、代谢类型多，一直是纤维素酶的主要来源，目前报道能产纤维素酶的微生物主要为细菌和霉菌，酵母罕见报道，仅见R．Potjewijd等分离自海洋和水果的Aureobasidium pullulans和Candida guillermondii两株产纤维素酶酵母报道。同时，由于酵母基因组易于改造，以酿酒酵母为载体构建了大量基因工程菌，Jungu Bae等研究了利用重组酿  酒酵母生产燃料乙醇，但重组酵母可能对生态环境产生不确定影响。因此，寻找能够直接降解纤维素的酵母菌株仍是重要研究方向。

 试验从浓香型白酒糟醅中筛选到3株可稳定降解纤维素的酵母菌株，并对其中1株酵母开展产纤维素酶条件初步研究，为该酵母在酿造行业及其他相关产业中的应用提供理论依据。

  1材料与方法

  1.1菌株

 四川省宜宾市某浓香型白酒厂糟醅中分离的110株酵母菌株，现保存于固态发酵资源利用四川省重点实验室。

  1.2培养基

 YPD培养基、麦芽汁培养基，均用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液调节pH至5.8。

 产酶发酵基础培养基：1%羧甲基纤维素钠，0.4% (NH4)2SO4, 0.2% KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H2O,1%蛋白胨，0.5%牛肉膏。

  1.3产纤维素酶酵母菌的筛选与系统发育分析

  1.3.1产纤维素酶酵母菌的筛选

 菌株活化后接种于加有微晶纤维素的YPD平板中，28℃倒置培养3d，0.1%的刚果红溶液染色15 min后以1 mol/L的氯化钠溶液脱色15 min，观察，将有透明圈的菌株反复接种于加有微晶纤维素的YPD平板中，培养，采用刚果红染色法测量透明圈直径与菌落直径，选出稳定高产纤维素酶菌株。

  1.3.2产纤维素酶酵母菌的系统发育分析

 DNA的提取及系统发育分析的方法。

  1.4酶活测定

 参见GB/T 23881-2009。

  1.5酵母产纤维素酶条件研究

  1.5.1温度对酵母产纤维素酶的影响

 将接种的产酶发酵培养基分别置于28℃，30℃，32℃和34℃恒温摇床培养，每隔12 h检测纤维素酶活。

  1.5.2 pH对酵母产纤维素酶的影响

 将菌株接种于初始pH为5.4，5.8，6.2和6.6的产酶发酵基础培养基中，32℃恒温摇床培养，每隔12 h测定酶活。

1.5.3诱导物对酵母产纤维素酶的影响

 将菌株分别接种于YPD培养基和麦芽汁培养基中，32℃培养，每隔12 h检测纤维素酶活；同时加入微晶纤维素作为诱导物质，每隔12 h检测纤维素酶活力。

2结果与分析

2.1纤维素降解菌的筛选

 将从110株酵母中初筛得到的20株酵母菌在YPD固体培养基上活化，挑取单菌落接种于加有微晶纤维素的YPD平板中，培养，染色后测量透明圈大小，结果如表1。

 从表1可以看出，20株菌经再次传代培养染色后共得到17株具有分解纤维素能力的菌株，但经过15次传代培养后仍可降解纤维素的仅3株，其编号分别为S633y-28-1，S533y-36和H6y-22，比例仅为2.7%。

 将稳定产酶的S633y-28-1、S533y-36和H6y-22菌株纯化后培养，染色，并测量透明圈直径和菌落直径，结果如表2。

 由表2可得，3株稳定产酶菌株经15次传代培养后，其H/D值情况为：S533y-36>S633y-28-1>H6y-22，表明S533y-36菌株产纤维素酶的能力最高。

2.2产酶菌株的系统发育分析

 经PCR扩增，测序，所得序列与Gen Bank数据库中的酵母菌标准菌株对应序列比对，3株菌分属2个属，菌株S633y-28-1和H6y-22与模式菌株Lodderomyces elongisporus( GenBank: EF394940.1)的序列相似性为99%，菌株S533y-36与模式菌株Debaryomj，ceshansenii( GenBank:  HQ860269.1)的序列相似性为100%，表明S633y-28-1和H6y-22菌株为Loddero，r0，ces

elongisporus,S533y-36为Debaryomyces hansenii，利用MEGA6软件对3株菌及模式菌株构建系统发育树也印证了上述鉴定结果（图1）。

2.3 S533y-36菌株生长与产纤维素酶的关系

 由于S533y-36菌株在平板试验中体现出更好的酶活性，故选择S533y-36菌株进行产酶条件研究。首先，在YPD培养基（自然pH）中32 0C下培养，通过测定OD560nm监测酵母生长状况，分析S533y-36菌株生长与产纤维素酶的关系，如图3所示。

 可以看出，S533y-36酵母菌株在接种12 h内生长缓慢，12 h后其OD560nm呈现对数生长趋势，在36 h达到最大值，之后进入稳定期，其后基本维持稳定，直至60 h左右由于酵母自溶或絮凝沉降导致OD560nm下降。产酶曲线与之相似，表明该菌株生长与产酶大致同步。但24～36 h之间，酶活性的增长速率明显慢于酵母细胞数量的增长速率，表明对数后期形成的酵母细胞产酶能力较低。一方面可能是由于酵母代谢废物累积抑制了其酶活性；另一方面，纤维素酶可由酶促反应的产物和类似底物的某些物质引起竞争性抑制，比如纤维二糖、葡萄糖和甲基纤维素通常是纤维素酶的竞争性抑制剂，由于对数前期产生较多的纤维二糖等物质，导致对数后期酶活受到抑制。

2.4温度对S533y-36菌株产纤维素酶的影响

 酵母的最适生长温度为290C～30℃，发酵时的温度一般为30℃～32℃，试验研究的是筛选自白酒糟醅的酵母菌株，故设置温度范围为28℃～34℃，其在不同培养温度下酶活如图3所示。

 由图3可知，在28℃和30℃的较低温度时，产酶相对较低。一方面，温度较低时，微生物的代谢缓慢，酶的生成速率低；另一方面，纤维素酶是胞外酶，其结合于细胞膜上，当温度较低时不利于细胞膜的流动，酶的释放缓慢。当为32℃时，其产酶效果最好，从24 h后一直处于最高，但是当温度高于32℃时，产酶降低，推测是温度过高导致酵母细胞提早衰老死亡，从而代谢能力减弱。由此可得，该酵母菌株的最适产酶温度为32℃。

2.5 pH对S533y-36菌株产纤维素酶的影响

 由于该株酵母生长于酸性环境，故试验初始pH设置为5.4，5.8，6.2和6.6，其在不同的初始pH下酶活如图4所示。

 由图4可知，在培养基初始pH为5.8时，培养液中纤维素酶活性达0.45 U．mL-1，其次是pH 6.2，当培养基初始pH为5.4或6.6时，培养36 h时的培养液中纤维素酶活性分别降低14.5%和21.7%，说明酶活性受初始pH影响较大，这可能是由于pH-方面影响酵母生长，即影响产酶细胞的数量，另一方面，H+本身可能对产酶相关代谢途径或酵母细胞膜通透性有一定影响。对该酵母菌而言，其产纤维素酶的最适pH为5.80

2.6微晶纤维素对S533y-36菌株产纤维素酶的影响

 基于对温度和pH的研究，将该酵母菌接种到pH5.8的麦芽汁培养基和YPD培养基中，32℃培养，监测培养液中纤维素酶活性变化，探究微晶纤维素对该酵母菌株在两种培养基中的产酶情况，结果如图5和6所示（试验组添加微晶纤维素，对照组不加）。

 由图5和6可以看出，微晶纤维素在两种培养基中均可诱导S533y-36菌株产纤维素酶，且其趋势相似，两种培养基的处理及对照均在36 h左右酶活性达到最高，在YPD培养基中处理的最高酶活性高于对照22.2%，麦芽汁培养基中处理的最高酶活性高于对照22.4%，特别是在YPD培养基中，36 h后试验组与对照组的纤维素酶活性差距进一步扩大，到60 h达到26.7%。

 同时，可以看出，该酵母菌在麦芽汁培养基中的最高酶活比YPD培养基高27.4%，可能与S533y-36菌株的代谢调控有关，麦芽汁培养基中主要含麦芽糖等二糖类物质，而YPD培养基中主要是葡萄糖，S533y-36菌株在含有葡萄糖时会首先利用葡萄糖作为碳源，不会直接诱导产生各种酶分解其它二糖和多糖类物质，另外，培养基中的葡萄糖对纤维素酶生成具有反馈抑制作用，因此出现上述情况。

3结论

  筛选的S533Y-36菌株在32℃，pH 5.8的麦芽汁培养基中培养36 h，发酵液中纤维素酶活性高达1.84U．mL-1，故表明该菌具备在偏高温( 32℃)、偏酸性条件下( pH 5.8)短时间(36 h)内产生较高纤维素酶的能力，且筛选自白酒糟醅，其安全性和可靠性较好，不会对生态环境产生破坏，对营养要求不高，故可以用于饲料和酿造行业以及其他相关行业中，降低生产成本，得到较好的产品。