酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物及黏度测定

2016-08-15 10:35:53 安装信息网

齐微微，刘慕君，梅斯杰，蔡兴航，王艳菲，于国萍*

东北农业大学食品学院（哈尔滨150030）

摘要利用谷氨酰胺转氨酶改性乳清蛋白制备可溶性聚合物，以单因素试验和正交试验探讨了加酶量、反应温度、pH、反应时间和4℃冷藏时间对乳清蛋白可溶性聚合物的黏度影响，优化了可溶性聚合物的制备工艺。结果表明，四因素对聚合物黏度影响的主次关系为：反应温度>pH>反应时间>加酶量，反应温度和pH/-j-黏度的影响显著。当聚合物的初始黏度（冷藏0 h）为30- 35 m Pa．s时，随着4℃冷藏时间的延长(0，2，4和6 h)，可溶性聚合物黏度逐渐增大，黏度增速适宜，冷藏6h之后形成凝胶。可溶性聚合物制备条件为反应温度50℃、反应时间60 min, pH和加酶量5U/g，所得的聚合物黏度适宜易于应用，稳定且具有高凝胶性。

关键词乳清蛋白；谷氨酰胺转氨酶；可溶性聚合物；黏度

乳清蛋白可溶性聚合物为介于蛋白单体与不可溶性凝胶网络结构或沉淀的一种中间状态，也称为溶胶或可流动的凝胶。乳清蛋白改性制备的可溶性聚合物( Soluble aggregates，SA)，改善并拓展了乳清蛋白在起泡、乳化、凝胶、成膜和包埋等方面的应用。正因为SA具有多样的结构和理化的性质，其在食品中的应用相当广泛。

关于谷氨酰胺转氨酶( TGase)改性乳清分离蛋白( WPI)制备聚合物国外的研究较多。S．N．Anuradha研究了TGase( 37 0C，2h)交联WPI对其浊度的影响。Cony Gauche优化了TGase交联乳清蛋白聚合的条件，并研究酶交联对于溶液流变性的影响。但是关于TGase改性乳清蛋白制得聚合物黏度的研究报道很少。国内乳清蛋白热聚合的研究鲜有报道，以乳清浓缩蛋白为原料，研究乳清浓缩蛋白在非常规条件下( pH 1.8)制备乳清浓缩蛋白纳米纤维。利用

TGase聚合大豆蛋白和乳清蛋白形成高耐热、耐酸的蛋白聚合物；经加热预处理(85 0C，15 min)的WPI,可以利用TGase催化其聚合，同时添加还原剂( DTT)，可明显提高MTGase对WPI的催化活性。关于TGase催化WPI形成凝胶有研究，但是，TGase催化WPI聚合形成高黏度可溶性聚合物的影响未见研究，试验旨在研究低剂量的TGase催化聚合乳清蛋白可溶性聚合物的制备及其黏度测定，这将有利于进一步了解TGase催化蛋白聚合的机制。为开发蛋白基质的食品稳定剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

乳清分离蛋白( WPI)，蛋白质含量90.90%：新西兰Fonterra公司；谷氨酰胺转氨酶(TGase)，酶的活力为100 U/g：泰兴市一鸣生物制品有限公司；其余所有试剂均为分析纯。

1.2主要仪器与设备

PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；NDJ-5S旋转黏度计：上海精密科学仪器有限公司；数显恒温磁力搅拌水浴锅：常州赛普仪器厂；H-1微型漩涡混合器：上海精科实业有限公司。

1.3试验方法

1.3.1乳清分离蛋白溶液的制备

准确称取11.16 g WPI，用100 m L去离子水溶解，制得11.16%的乳清蛋白溶液，采用凯氏定氮方法测定该溶液的蛋白含量为10%。将溶液轻轻搅拌60min，在4℃条件下冷藏12 h，消除泡沫并使蛋白充分水合。

1.3.2不同反应条件对TGase改性WPI制得可溶性聚合物黏度的影响

1.3.2.1 TGase改性WPI单因素试验设计

分别考察反应时间(30，60，90，120和150min)、反应温度(30 ℃，40℃，50 ℃，60℃和70℃)、pH (7.25, 7.50, 7.75, 8.00, 8.25和8.75)和加酶量（1，3，5，7和9 U/g）对TGase交联WPI聚合物在不同的冷藏时间下的黏度影响。

1.3.2.2谷氨酰胺转氨酶改性乳清蛋白正交试验设计

在单因素试验的基础上，每个因素选取3个适宜水平，设计L9(34)正交试验，优化TGase改性WPI制备乳清蛋白可溶性聚合物的最佳条件，结果见表1。

1.3.3乳清蛋白可溶性聚合物黏度的测定

制备的可溶性聚合物冷却至室温，测定其黏度，即为0 h黏度，之后将样品置于4℃冰箱冷藏，分别测定聚合物冷藏2，4和6h的黏度。1 min之内，每隔20s计数，3个数值取平均值。

1.4统计分析

试验数据均使用SPSS 18.0软件进行统计分析，所用数据均为三次的平均数，单因素方差分析( ANOVA)中采用Duncan检验，图表中同一条曲线标有相同字母者为差异不显著(p>0.05)，有不同字母者为差异显著(p≤0.05)。作图采用Sigma Plot 9.0软件。

2结果与分析

2.1酶添加量和冷藏时间对聚合物黏度的影响

加酶量不同制得的聚合物冷藏不同时间黏度的变化如图1所示。聚合物冷却至室温（记为0h），聚合物盼黏度随着加酶量的增加而增大。同一加酶量，随着冷藏时间的延长，黏度增大。但是加酶量不同，随着冷藏时间的延长，黏度的增加速率不同，对照组（加酶量为0 U/g）冷藏6h黏度从10.9增加到103.3 m Pa.s，而加酶量为9 U/g时，聚合物的黏度从32.0增加到6 536.6 m Pa．s。冷藏24 h之后，黏度均超过了10万m Pa．s，形成凝胶。

a-乳白蛋白的肽链中有8个谷氨酸残基和12个赖氨酸残基；而p-乳球蛋白有16个谷氨酸残基和15个赖氨酸残基，然而由于乳蛋白的球状结构，不是所有的残基都能被谷氨酰胺转氨酶所交联。TGase的交联度依赖于蛋白的分子结构，即参加反应的谷氨酸残基数量和多肽链的柔性。一般来说，酶/底物值越大，越有利于酶催化底物。当底物浓度一定时，加酶量会存在一个临界值。试验乳清蛋白浓度为10 g/100mL，加酶量最大为9 U/g，远没有达到酶浓度的最大值，所以随着加酶量的增大，黏度一直增大，随着冷藏时间的延长增速变大。但是黏度增加过大，聚合物会形成不可流动的固体凝胶，试验制备的是可溶性聚合物，所以加酶量选择在5～9 u/g。

2.2 pH和冷藏时间对聚合物黏度的影响

图2表示在不同pH条件下，4qC冷藏0，2，4和6h聚合物的黏度变化。酶的活力受pH的影响，不同酶具有不同的最适pH，在最适pH下，酶的活性最高，催化交联效果最好。有研究认为转谷氨酰胺酶的最适pH范围为7.00～9.00。从图2b中可知，聚合物0h的黏在pH 8.00时最大为27.0 m Pa．s，但当pH为8.25、8.50时，黏度变化无显著性差异，这与胡慧玲研究PHXt TGase交联WPI黏度的影响相符。

聚合物冷藏2h后，黏度均增大，pH 8.25时黏度最大，之后黏度降低。随着冷藏时间的延长，在各个DH条件下，聚合物的黏度逐渐增大，但是增加速率不同，pH 8.25时聚合物增速最大，但是冷藏24 h后，均形成黏度大于10万mPa．s（除pH 7.25）的凝胶。所以在pH 8.00～8.50时TGase改性WPI制得聚合物0h时黏度较大，且随着冷藏时间的延长，黏度增速较快，易于形成凝胶。

2.3反应时间、冷藏时间对聚合物黏度的影响

聚合物冷藏0 h时（图3b）随着反应时间的延长，谷氨酰胺转氨酶交联作用时间长，聚合物的黏度逐渐增大。当反应时间超过150 min时，聚合物的黏度仍会继续增大，但是黏度太大，冷藏2h黏度15 000m Pa．s，冷藏6h黏度超过10万m Pa．s，不符合研究要求，所以反应时间在60～120 min较适宜。

2.4反应温度、冷藏时间对聚合物黏度的影响

由图4b可知，在冷藏0h时，聚合物的黏度随着温度的升高而增大，超过60 ℃聚合物的黏度降低，这是由于Gasses催化WPI聚合有一个最适温度范围。王金水、于国萍等㈣研究TGase的最适温度为45℃~55℃ , 60 ℃时酶的活力受抑制．在60 ℃时，未冷藏聚合物(0h)的黏度最大，可能由于温度升高，乳清蛋白热变性利于聚合所以黏度提高，而温度超过60℃ ，

TGase因失活聚合能力下降，聚合物黏度降低。

随着冷藏时间的延长（图4a），聚合物的黏度逐渐增大，但是不同的反应温度，黏度的增速不同，温度越高，增速越大。当冷藏4h时，加热温度70 cC聚合物黏度超过60℃的黏度，可能是热变性的乳清蛋白冷藏更易聚合，但是黏度增速太大，不利于应用，所以温度在50℃~60℃比较适宜。

2.5 TGase改性WPI制得可溶性聚合物正交试验设计

以反应温度(A)、pH (B)、加酶量(C)和反应时间(D)较优水平进行L9(34)正交试验，确定酶改性乳清分离蛋白制备可溶性聚合物的最优工艺条件。

以聚合物冷藏Oh的黏度为指标进行极差分析确定4个因素对聚合物黏度影响的主次关系依次为：A>B>D>C，即温度影响最大，酶添加量影响最小(表2)。以影响因素C（加酶量）为误差项对上述试验结果进行方差分析，结果如表3所示，可以看出因素A（反应温度）和B( pH)对聚合物的黏度影响均显著(p<0.05)。也就是说，在实际操作过程中，只有严格控制该酶反应的温度和pH，才能达到预期的目的。

根据前期试验得出，当制得聚合物的黏度在30～35 m Pa．s时，聚合物随着冷藏时间的延长，黏度增速适宜，易于形成凝胶，所以利用Design-Expert软件的优化功能，将黏度的优化指标设定为30～35m Pa．s，经软件分析，得出可行方案11个，如表4所示。同时考虑效率及经济性等因素，最终选择A1B2C3D1最优，即温度为40℃，pH为8.25，酶添加量为5 U/g，反应时间为60 min。按此条件进行验证试验，制得的聚合物0h黏度为29.8 m Pa．s，冷藏2，4和6h的黏度分别为2 165, 35 000和85 900 m Pa．s，黏度未超过10万m Pa．s，黏度增速适宜。